La cytométrie spectrale est une nouvelle
approche de la cytométrie classique.
Là où un détecteur correspondait à une couleur, le cytomètre
spectral collecte les fluorescences de petites bandes spectrales
pour chacun des lasers présents dans l'appareil.
La déconvolution spectrale permet de décomposer le spectre de
lumière émis par chaque cellule en chacune des composantes
spectrales issue de chaque fluorochrome présent sur la cellules,
quelquesoit le nombre de molécules fluorescentes (Figure 1).
Figure 1 : Pour chaque laser, le spectre est découpé en
petite bandes spectrales permettant de calculer un spectre
spécifique pour chaque fluorochrome analysé: à gauche
découpage du spectre pour le laser bleu; à droite découpage
global d'un spectre sur 5 lasers.
(Front. Mol. Biosci., DL Bonilla, G Reinin, E
Chua)
Avant toute analyse par cytométrie spectrale, nous avons
besoin d’extraire les spectres des fluorochromes utilisés un
par un.
A cette fin, il faut
analyser :
1) Des cellules
totalement non marquées. L’autofluorescence des cellules
est en effet considérée comme un fluorochrome. Il est donc
possible d’évaluer le spectre d’autofluorescence et le
soustraire aux signaux de fluorescence.
2) Tous les monomarquages
individuels. La
préparation du monomarquage doit être identique à celle de
l’échantillon (dissociation, lavages, perméabilisation,
fixation…). En cas d’incertitude sur la présence d’un
marqueur sur vos cellules (ou de manque de cellules pour les
contrôles) et afin de faire l’extraction du spectre, il faut
prévoir des billes qui fixent vos anticorps. Les billes
doivent subir les mêmes traitements que les cellules. Il
existe aussi des billes spécifiques pour les marqueurs de
viabilité.
Une fois la déconvolution spectrale effectuée et l'obtention
de spectres spécifiques de vos fluorochromes (Figure 2),
l'analyse cytométrique peut enfin commencer de manière
classique avec des paramètres réduits aux nombre de
fluorochromes à analyser.
Figure 2 : Exemple de spectre calculé après déconvolution
spectrale de la PE sur un cytomètre spectral 5 lasers Cytek
Aurora
Cette
technologie permet d'analyser de façon plus fine les
fluorescences et permet par exemple de détecter dans un même
tube des molécules totalement indiscernables avec la
cytométrie classique. La technique permet de mesurer
simultanément des fluorochromes qui présentent jusqu'à 98% de
similarité (Figure 3 et 4).
Figure 3 : à gauche : Spectres de la GFP et de la YFP
(indiscernable sur un cytomètre classique); au milieu :
spectres de la GFP et da YFP après déconvolution spectrale
sur le Cytek Aurora (74% de similarité); à droite :
analyse simultanée de la GFP et de la YFP sur l'Aurora
Figure 4 : à gauche : spectres de
l'APC et de l'Alexa 647 (90% de similarité); à droite :
comparaison d'un double marquage APC, Alexa 647 avec le
même marquage APC, PE. Les pourcentages des populations
détectées sont similaires.
L'autre intérêt de la
cytométrie spectrale est de pouvoir soustraire le bruit de
fond des cellules analysées sur chacun des canaux mesurés
permettant ainsi de détecter des fluorescences spécifiques qui
seraient noyées dans le bruit de fond sur un cytomètre
classique (Figure 5)
Figure 5 : Analyse du marquage
spécifique mCherry au sein d'une population avec une forte
'autofluorescence'.
