MARQUAGE AVEC ANNEXINE V-FITC

Principe : Dans une cellule non-apoptotique les phosphatidylsérines membranaires ne sont situées que sur la face interne de la membrane. Dés qu'une cellule entre en apoptose, elles sont délocalisées et exprimées des deux cotés de la membrane.

L'annexine ayant une forte affinité pour ces phosphatidylsérines va marquer les cellules apoptotiques.

Il faut noter que les cellules mortes seront aussi marquées par l'annexine. Toutefois, il est possible de discriminer par double marquage les cellules apoptotiques des cellulles mortes (nécrotiques) en rajoutant de l'IP lors du marquage qui ne pénètrera que dans les cellules mortes. Les cellules apoptotiques mais pas mortes seront Ann+IP- et les cellules mortes Ann+IP+.

MATERIEL :

-Annexin V-FITC : Roche Diagnotic, Ref 11828681. Aliquoter par 10µl et congeler. Au moment de l'utilisation décongeler et diluer dans 500 µl de tampon Annexine  ± 10 µl d'IP solution stock.

-Tampon Annexin : 140 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 10 mM Hepes( PM=238)/NaOH pH 7,4

(pour 200 ml: 1,636 g NaCl, 110 mg CaCl2 et 476 mg d'Hepes)

Garder un tube à 4°C et congeler le reste.

-Solution stock d'IP à 50 µg/ml.

 PROTOCOLE :

2.10⁵ à 10⁶ cellules dans tube 5 ml pour FACS lavées une fois

resuspendre le culot cellulaire avec 100 µl d'Annexine-FITC, 15 mn à 4°C

MARQUAGE AVEC ANNEXINE V-bioltine-PE

MATERIEL :

-Annexin V-biotin : Roche Diagnotic, Ref 11828690. Aliquoter par 10µl et congeler. Au moment de l'utilisation décongeler et diluer dans 500 µl de tampon Annexine .

-Tampon Annexin : 140 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 10 mM Hepes( PM=238)/NaOH pH 7,4

(pour 200 ml: 1,636 g NaCl, 110 mg CaCl2 et 476 mg d'Hepes)

Garder un tube à 4°C et congeler le reste.

-Streptavidine-PE : Coulter/Immunotech, RefIMO557. Utiliser au 1/50 dans tampon Ann.

PROTOCOLE :

2.105 à 106 cellules dans tube 5 ml pour FACS lavées une fois

resuspendre le culot cellulaire avec 100 µl d'Annexine-biotine, 20 mn à 4°C

Laver dans 1 ml tampon Annexine

 Rajouter 100 µl de streptavidine-PE, diluée au 1/50 dans tampon Ann. 20' à 4°C

 Laver dans 1 ml tampon Annexine

 Rajouter 300 µl de tampon Annexine et passer au FACS