APOPTOSE

 MARQUAGE DU DNA PAR L'IODURE DE PROPIDIUM

MATERIEL :

-Iodure de propidium , ex. Sigma Ref. P4170. Préparer une solution concentrée à 1 mg/ml. Garder à  4°C.

- RNAse : ex RNAse A Boehringer Ref. 109169, chauffée 15 mn à 100°C, stocker à  -20°C

-Solution de marquage : IP à 40 µg/ml plus RNAse à 100µg/ml dans du PBS, stocker à 4°C.

 2.105 à 106 cellules dans tube 5 ml pour FACS lavées une fois

 resuspendre le culot cellulaire avec 750 µl d' un mélange 75% ethanol / 25% eau  à tp. ambiante pendant environ 1 à 2 mn

centrifuger, resuspendre dans 500 µl d' une solution d' IP à 40 µg / ml dans du PBS contenant 100 µg /ml de RNAse DNAse free.

incuber 1 à 2 h à 37° C

laisser à 4°C et passer les tubes au FACS quelques heures aprés (1ou 2 jours à 4°C permettent quelques fois une meilleure résolution du pic d'apoptose).

analyse du  cycle possible

NB: L'iodure de propidium est trés toxique, mettre des gants (et un masque pour peser).Ne pas vider les tubes à l'évier.

REFERENCE :

-J Exp Med 1994, 179:1789

-J Exp Med 1992, 176:1043