Marquage de la phase S par du BrdU

SOLUTIONS:

PBS-BSA-Azide (BSA:1% = 10g/l; Azide 0,02%) sans Ca ni Mg.

PBS-Azide (Azide 0,02%).

PBS avec Ca et Mg.

PFA 2% , glucose 30mM (1 litre de PBS + 20g de PFA + 5,4g de glucose).

PBS-PFA-Tween (solution de PFA 2% + tween 20 à 0,01%).

PBS-BSA-Tween (PBS + 10% de BSA + 0,5% de Tween 20).

DNase diluée au 1/5 dans du PBS Ca Mg (préparée à partir d'une solution stock à 10Unités Kunitz/ml dans 50% de glycérol; DNase Sigma, ref DN25).

PROTOCOLE:

Mettre les cellules à tester à 106/ml dans du milieu de culture avec SVF.

Incuber stérilement  5minutes à 37°C avec 10ml de FUdr 100x par 106 cellules (pour bloquer la synthèse de dThd).

Incuber stérilement  60 minutes à 37°C avec 10ml de BrdU 100x par 106 cellules (se substitue à dThd).

Laver 1 fois avec PBS-BSA-Azide puis une fois avec PBS-Azide.

Fixer en PBS-PFA-Tween (1 nuit à 4°C).

Laver 1 fois avec PBS-Azide puis une fois avec PBS Ca Mg.

Bien enlever le surnageant.

Ajouter 50 ml de solution de DNase pour 2 106 cellules.

Incuber 30 minutes à 37°C.

Laver 1 fois en PBS-azide.

Incuber en présence de 50ml de PBS-BSA-Tween et de l'anti-BrdU-FITC à la concentration adéquate, 45 minutes à température ambiante.

Laver 2 fois en PBS-Azide.

Resuspendre dans 1 ml de PBS-Azide pour analyse.

COMMENTAIRE:

Cette technique peut être précédée d'un marquage membranaire en immunofluorescence directe (PE).