Détail des techniques du laboratoire

+l’étude de la prolifération de divers types cellulaires (lignées, lymphocytes...) par le marquage de l’ADN par divers colorants comme l’iodure de propidium, le bromure d’éthidium ou encore le Hoechst ou le DAPI,

+l’analyse de populations cellulaires marquées avec des anticorps monoclonaux (multiples marquages). Nous pouvons associer ces techniques de triple marquage à la technique d’analyse de la prolifération (marquage de l’ADN par le Hoechst) par l’utilisation du deuxième laser de notre trieur de cellule. Cette dernière approche devient difficile d’accès vu la faible puissance du laser UV.

+ la quantification de protéines membranaires par l’utilisation de standards calibrés (QIFIKIT). Ce système permet de connaître le nombre absolu de molécules présentes à la surface d’une cellule.

+ étude de l’apoptose. Les mesures, par la cytométrie en flux, de la mort cellulaire programmée ont connues un grand développement ces dernières années. Plusieurs techniques sont utilisées : le marquage simple de l’ADN avec perméabilisation des cellules à l’éthanol pour permettre la libération des corps apoptotiques, le marquage de l’ADN par un colorant vital de l’ADN (Hoechst) et un marquage des cellules mortes par l’iodure de propidium, le marquage de la fragmentation de l’ADN par l’incorporation de dUTP biotiné par la Terminal déoxynucléotide Transferase et révélation par de la streptavidine fluorescente, le marquage par mesure de l’anexine fluorescente couplée à l’incorporation d’iodure de propidium.

+l’étude de l’expression de protéines en fonction du cycle cellulaire. Ce travail passe par une synchronisation des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire au moyen d’hydroxyurée ou de thymidine. Une fois cette synchronisation montrée par cytométrie en flux, l’étude de l’expression de diverses protéines peut être effectuée au moyen d’autres techniques.

Les possibilités offertes par ces appareils d’analyse sont largement en retrait par rapport aux possibilités offertes par les nouveaux matériels. Nous utilisons le trieur de cellules pour des analyses de plus de 3 marqueurs avec le désavantage d’avoir beaucoup moins de sensibilité et une mise en oeuvre beaucoup plus délicate lors de l’analyse de grande séries d’échantillons. Il devient urgent de renouveler notre analyseur afin de rester compétitif vis-à-vis des laboratoires nationaux et internationaux.

Le tri cellulaire fait appel aux techniques d’analyse précédemment citées mais en plus les cellules peuvent être en plus isolées avec des taux de pureté supérieurs à 99%. Ces taux de puretés sont inversement proportionnels à la vitesse de tri. Ces cellules sont parfaitement viables et peuvent être remises en culture. La CMF a permis de préparer ces cellules de façon stérile et fonctionnelle. Les cellules ainsi obtenues peuvent être utilisées dans de nombreux tests fonctionnels et/ou amplifiées pour en extraire par la suite le composé recherché (ADN, ARN, protéine…). Les vitesses de tri obtenues sont de l'ordre de 20 000 cellules/seconde et le processus n'affecte pas la viabilité des cellules et ni leur capacité à se diviser. Le rendement de purification est d'environ 70%. De plus, cette méthodologie de tri à haute vitesse permet de purifier sur la base de plusieurs critères (taille, granularité, 5 marqueurs fluorescents).

Un autre domaine est aussi développé, celui de l’étude de différents gènes. Celle-ci passe par leur intégration dans des systèmes contrôlables par l’expérimentateur. Ces constructions sont intégrées dans des cellules que l’on peut cultiver facilement afin d’expérimenter le gène en question. Le problème réside dans la pureté de ces cellules transfectées. En effet, les rendements dépendent des constructions et des cellules qui les reçoivent et dans la majeure partie des cas les cellules ayant intégrées le gène sont très largement minoritaires. Il existe des milieux de sélection, mais la méthode est longue et il arrive fréquemment que le gène intégré soit perdu au cours de la culture. L’apport du tri cellulaire et des gènes reporteurs a permis de résoudre ces problèmes.

L'intégration, dans une construction à transfecter, d'un gène codant pour une protéine de surface détectable par immunofluorescence, permet de purifier, sur la base de l'expression membranaire de la protéine, la population ayant intégré ce gène. Ce système a été testé pour introduire des gènes dans des cellules hématopoïétiques humaines ainsi que des lignées cellulaires. Le gène reporteur utilisé codait pour un CD4 murin tronqué qui présentait l'avantage de n'être ni fonctionnel ni révélé par des anticorps humains.

Il existe des enzymes qui peuvent transformer des substrats non fluorescents en produits fluorescents. L'intégration dans des constructions de gènes codant pour de telles enzymes permet de révéler la présence de la construction dans la cellule en incubant les cellules transfectées en présence dudit substrat. La cellule devient alors fluorescente. Ce système a été décrit en 1988 et faisait appel à un rétrovirus recombinant qui portait le gène de la ß-galactosidase d'Escherichia coli. Depuis d'autres gènes codant pour d'autres enzymes ayant des propriétés similaires mais pouvant être mesurés séparément ont été décrits.

Un autre système utilise un gène codant pour une protéine qui émet naturellement une fluorescence verte. La GFP (green fluorescent protein) a été extraite dans un premier temps d’une méduse (Aequorea Victoria). L'intégration de ce gène dans la construction rendra la cellule fluorescente si la cellule est transfectée et permettra ainsi de la trier. Cette méthode évite toute étape de révélation puisque la protéine codée est naturellement fluorescente. Il existe maintenant toute une panoplie de gènes de type GFP codant pour des protéines possédant des propriétés spectrales différente. L'utilisation de ces différentes "GFPs" permet d'analyser plusieurs constructions simultanément.