Fiche de tri

 

https://www.mri.cnrs.fr/images/documents/E_MRI_DOC_0029_F_DEMANDE_DE_TRI.docx

 

Elle doit nous être envoyée par mail au moment de la réservation pour qu’on puisse valider la faisabilité du tri (fluorochromes utilisés et durée du tri) . Pour les tris avec incertitude, la fiche de tri doit nous être envoyée au plus tard la veille du tri. Quand vous faites la même expérience avec les mêmes marqueurs plusieurs fois d’affilée, vous pouvez envoyer une seule fiche de tri indiquant la période concernée.

 

Nombre de cellules «triables» et durée du tri

Deux tailles de buses possibles (70 et 100 microns), qui permettent de trier une large gamme de tailles de cellules. Agrandir la taille de la buse permet aussi de trier des cellules à une pression inférieure (pour les cellules fragiles).

-A basse pression (buse 100µ/15 PSI) la vitesse maximale est d’environ 3 000 cellules/seconde. Il est donc possible de trier au maximum 11 000 000 cellules/heure.

-A pression intermédiaire (buse 100µ/25 PSI) la vitesse maximale est d’environ 5 000 cellules/seconde. Il est donc possible de trier au maximum 18 000 000 cellules/heure.

-A haute pression (buse 70µ/68 PSI) la vitesse maximale est d’environ 20 000 cellules/seconde. Il est donc possible de trier au maximum au 70 000 000 cellules/heure.

Attention : Ces chiffres prennent en compte tous les évènements détectés par le trieur y compris les cellules mortes et les débris. En tenir compte dans vos calculs.

Exemple de calcul : Même si l’efficience du tri est souvent entre 75 % et 95 %, il faut toujours calculer le nombre de cellules de départ en se basant sur une efficience de 50 % afin d’être sur d’avoir suffisamment de cellules. Si la population d’intérêt représente par exemple 10 % de la totalité de l’échantillon, pour avoir 1M de cellules triées il faudra partir de 20M de cellules.

 

Exemple de calcul de temps de tri
Taille Buse/Pression

100µ/15 PSI 100µ/25 PSI 70µ/68 PSI
Type cellulaire Cellules très fragiles Conditions intermédiaire Petites cellules non fragiles
Vitesse moyenne de tri 1 000-3 000 evts/sec 2 000-5 000 evts/sec 10 000-20 000 evts/sec
Temps nécessaire*
environ 3 heures
 environ 1 heure 30
environ 20 minutes
*pour trier 1M de cellules d’une population exprimée à 10 %


 

Contrôles

Pour la cytométrie spectrale, nous avons besoin d’extraire les spectres des fluorochromes utilisés un par un.

A cette fin, il faudra apporter :

1) Des cellules totalement non marquées. L’autofluorescence des cellules est en effet considerée comme un fluorochrome. Il est donc possible d’évaluer le spectre d’autofluorescence et le soustraire aux signaux de fluorescence.

2) Tous les monomarquages individuels.  La préparation du monomarquage doit être identique à celle de l’échantillon (dissociation, lavages, perméabilisation, fixation…). En cas d’incertitude sur la présence d’un marqueur sur vos cellules (ou de manque de cellules pour les contrôles) et afin de faire l’extraction du spectre, il vous faudra prévoir des billes qui fixent vos anticorps. Les billes doivent subir les mêmes traitements que les cellules. Il existe aussi des billes spécifiques pour les marqueurs de viabilité.

Attention : Il faut éviter d'utiliser des billes pour les fluorochromes tandems (par exemple : PE-Cy5.5, APC-Cy7, BV570, QDOT655..) car l'extraction des spectres ne se fait pas correctement quand elle est appliquée aux cellules :


Attention : Pour le contrôle non marqué, il nous faut minimum 100 000 cellules (dans environ 200-300 µl) et pour les contrôles positifs nous avons besoin de minimum 200 cellules positives afin d’extraire les spectres.


Choix des fluorochromes

Afin de vous aider au mieux dans le choix des fluorochromes, Cytek a préparé un document téléchargeable spécifique de notre configuration :
https://welcome.cytekbio.com/hubfs/Website%20Downloadable%20Content/Data%20Sheets/Fluorochrome%20Guides/N9_20018_Rev._A_4L_VBYGR_Fluor_Guide.pdf


Ne pas non plus oublier les règles de préparation d'un multimarquage :
-les longueurs d’onde d’excitation des fluorochromes correspondent aux sources lumineuses du cytomètre,
-les longueurs d’onde d’émission sont suffisamment éloignées pour que leurs signaux soient analysés séparément.
-les antigènes faiblement exprimés sont révélés par des fluorochromes à fort rendement et les antigènes fortement exprimés avec des fluorochromes à faible rendement. Pour vous aider sur ce point, les principaux fluorochromes sont présentés avec leur brillance (stain index) dans la figure suivante :

Brillance
-dans le cas d’une co-expression sur une cellule, utiliser des fluorochromes dont les spectres se chevauchent peu ou pas.

Elimination des cellules mortes

L’élimination des cellules mortes peut se faire sur la base des paramètres physiques side scatter (SSC)  et  forward scatter (FSC) pour des échantillons de lignées cellulaires. L’addition d’un marqueur de cellules mortes (comme l’Iodure de propidium, le DAPI, Sytox…) permet une élimination plus précise pour des échantillons plus complexes. En cas d’utilisation d’un marqueur de viabilité, le contrôle négatif (unstained) ne doit pas contenir le marqueur.

 

Filtration des cellules

La filtration des cellules, juste avant le passage au trieur, permet d’éviter les bouchages qui déstabilisent le tri et diminuent la pureté des fractions récoltées. Pour cela vous pouvez utiliser des filtres à 40 microns.

 

Conditionnement des cellules avant tri

Les cellules peuvent être apportées dans du PBS ou du milieu de culture.

Les cellules doivent être apportées dans des tubes de 5ml (référence Falcon 2054) sous un volume minimum de 300 µl à:

                5x106 cellules/ml maximum pour un tri basse pression

                1x107 cellules/ml maximum pour un tri pression intermédiaire

                2-5x107 cellules/ml maximum pour un tri haute pression

Attention : Plus le volume à passer est grand, plus long sera le tri.

 

Tubes de récolte

Les cellules peuvent être récoltées après tri dans des tubes (tubes Eppendorf 1,5ml, tubes FACS de 5ml, tubes falcon de 15ml) ou des plaques (96, 24,12 et 6 puits). Il est conseillé de mettre du milieu de culture dans les tubes de collections.

Avec la buse 100µ on peut récupérer environ :

                1x106 cellules dans un tube de 5ml

                3x106 cellules dans un tube de 15ml

avec la buse 70µ :

                3x106 cellules dans un tube de 5ml

                9x106 cellules dans un tube de 15ml

Adapter le nombre de tubes de récolte au nombre estimé de cellules recueillies pour chaque fraction.