QUIFIKIT

I PRINCIPE DU TEST

L'échantillon cellulaire est marqué avec un anticorps (Ac) monoclonal primaire de souris dirigé contre l'antigène à étudier et, dans un autre tube, marqué avec un Ac monoclonal de souris irrelevant (contrôle). Ensuite, les échantillons cellulaires, les billes de réglage et de calibration sont marqués en parallèle avec un Ac secondaire anti-souris conjugué à la fluorescéine.

L'Ac primaire est utilisé à concentration saturante. Il peut être de n'importe quel isotype IgG de souris. Dans ces conditions, le nombre de molécules d'Ac primaire fixé corresponds au nombre de sites antigéniques présents à la surface cellulaire.

L'Ac secondaire est utilisé de la même façon. Dans ces conditions, la fluorescence est corrélée au nombre de molécules d'Ac primaire fixé sur les cellules et sur les billes.

Les billes de réglage sont analysées sur le cytomètre afin de déterminer la région d'analyse. Ces billes sont constituées d'un mélange de billes négatives (A) et de billes de forte intensité de marquage.

Les billes de calibration sont ensuite analysées pour établir une courbe étalon (intensité moyenne de fluorescence contre la capacité de liaison de l'Ac).

L'échantillon est enfin analysé et la capacité de liaison de l'Ac (densité antigènique) est calculée à partir de la courbe étalon.

II PROCEDURE

A) Marquage par immunofluorescence.

1) Sur le culot cellulaire (de 10⁵ à 10⁶ cellules) ajouter l'Ac primaire en conditions saturantes. Pour le contrôle négatif, utiliser un anticorps primaire irrelevant.

2) Incuber à 4°C pendant 30 à 60 minutes.

3) Ajouter 3 ml de PBS-BSA 1%-Azide 0,01% et vortexer.

4)    a) Centrifuger à 300 g 5 minutes. Aspirer et éliminer le surnageant.

       b) Pendant la centrifugation préparer 2 tubes en mettant 100 µl de billes resuspendues (vortexées) du flacon 1 dans le tube de réglage et 100 100 µl de billes resuspendues (vortexées) du flacon 2 dans le tube de calibration.

5) Ajouter 3 ml de PBS-BSA 1%-Azide 0,01% et vortexer.

6) Centrifuger à 300 g 5 minutes. Aspirer et éliminer le surnageant.

7) Ajouter l'Ac secondaire en conditions saturantes.

8) Incuber à 4°C pendant 45 minutes.

9) Pour du sang total lyser les globules rouges, sinon passer à (10).

10) Ajouter 3 ml de PBS-BSA 1%-Azide 0,01% et vortexer.

11) Centrifuger à 300 g 5 minutes. Aspirer et éliminer le surnageant.

12) Ajouter 3 ml de PBS- Azide 0,01% (PBS-BSA 1%-Azide 0,01% si une fixation n'est pas nécessaire = lecture immédiate) vortexer.

13) Centrifuger à 300 g 5 minutes. Aspirer et éliminer le surnageant.

14) Répéter (12) et (13).

15)  a) Si la fixation n'est pas nécessaire, resuspendre le culot dans 500 µl de PBS-BSA 1%-Azide 0,01% et stocker les tubes à 4°C pour 2 heures maximum avant analyse.

       b) S'il faut fixer les cellules :

         * Resuspendre le culot dans 500 µl de PBS-Paraformaldéhyde 1%, 2 heures à température ambiante ou une nuit à 4°C.

         * Ajouter 3 ml de PBS- Azide 0,01% et vortexer.

         * Centrifuger à 300 g 5 minutes. Aspirer et éliminer le surnageant.

         * Resuspendre le culot dans 500 µl de PBS- Azide 0,01%. Stocker le tube à 4°C à l'obscurité si l'échantillon ne peut être analysé immédiatement.

16) Analyser les échantillons (billes et cellules) sur le cytomètre.

B) Acquisition des données.

1) Régler l'appareil en utilisant les procédures standards.

2) Mettre le signal de fluorescence étudié en amplification logarithmique.

3) Passer le tube de billes de réglage pour établir la région d'analyse et jouer sur le voltage du PMT de la fluorescence étudiée pour ajuster la fluorescence des billes blanches dans la 1^ère décade tout en ayant les billes de forte intensité visibles sur l'échelle (éliminer les aggrégats de billes en sélectionnant les singulets sur la base de FSC/SSC).

4) Sans changer le réglage de la fluorescence , analyser les billes de calibration et ensuite les cellules.

C) Analyse des données.

Déterminer l'intensité moyenne de fluorescence de chacune des populations de billes (A,..., F) et noter la valeur correspondante en utilisant le tableau suivant :

D) Calcul de la densité antigènique.

I) Définitions et unités.

La capacité de liaison des Ac est le nombre de molécules d'Ac primaire de souris par cellule ou bille.

L'équivalent bruit de fond Ac est la capacité de liaison des Ac de contrôle négatif des cellules ou des billes négatives (A).