MARQUAGE SPECIFIQUE DE L’ADN


En cancérologie, la détection de la cellule pathologique est l’application la plus développée. Cette détection repose essentiellement sur la mesure d’un contenu anormal d’ADN dans le noyau de la cellule tumorale. De très nombreuses études font maintenant appel à la mesure de l'ADN en cytométrie : dans le domaine végétal, animal, en parasitologie...

Marquage spécifique de l’ADN

Il existe de nombreux colorants de l’ADN pour les études en CMF.
Le Hoechst est un dérivé de benzimidazole qui émet une fluorescence bleue quand il est excité dans l’UV. Il a une haute affinité pour l’ADN et se lie préférentiellement aux bases A-T, mais ce n’est pas un intercalant. Le DAPI présente les mêmes caractéristiques que le Hoechst et peut être interchangé avec lui.
La mithramycine, la chromomycine sont des antibiotiques excitables à 445nm et qui émettent à 575 nm (orange). Ils se lient aux régions G-C par des mécanismes non-intercalants.
L’iodure de propidium et le bromure d’éthidium sont les colorants les plus utilisés. Ces deux colorants sont des intercalants aussi bien des doubles brins d’ADN que d’ARN. Tous les deux sont excitables dans le bleu et émettent dans le rouge (615 nm).

Il existe de très nombreuses autres molécules permettant de marquer l'ADN avec des caractéristiques spectrales très différentes permettant d'utiliser de nombreuses sources d'excitation différentes comme les Sytox (bleu, vert, orange, rouge), les Vybrant DyeCycle (violet, vert, rouge)...

Certaines ne franchissent pas la barrière membranaire comme l'IP, le DAPI et les Sytox. Cette propriété peut être exploitée pour différencier les cellules vivantes des cellules mortes puisque ces dernières ont perdues leur inégrité membranaire. Les cellules vivantes ne prennent donc pas le colorant alors que les cellules mortes deviennent fluorescentes. Il est aussi possible de perméabiliser celles-ci afin que le colorant puisse accéder à l'ADN.

D'autres au contraire comme les Vybrant peuvent diffuser au travers de la membrane cellulaire pour marquer l'ADN permettant d'obtenir les informations du contenu d'ADN sur des cellules vivantes.

Stœchiométrie de la coloration

Il est important que la fluorescence émise par la sonde soit proportionnelle à sa fixation sur l’ADN. Dans le cas contraire il n’est pas possible de mesurer un contenu en ADN précis.
Les intercalants, bien que leur fixation soit liée à l’accessibilité de l’ADN, sont plus utilisés pour mesurer les contenus en ADN car la teneur en A-T et G-C n’intervient pas dans leur fixation.

Elimination des doublets

La fiabilité des résultats repose sur la possibilité de ne pas prendre en compte les agrégats cellulaires. En effet, comment distinger un agrégat de 2 ou plusieurs cellules puisqu'au final la quantité d'ADN mesurée sera le multiple de la quantité d'une cellule unique..

La méthode utilisée repose sur la possibilité d'analyser le profil du signal recueilli, son aire, sa hauteur ou son temps de passage (temps de vol, time of flight, TOF, width selon la machine) (Figure 1).

Format Signal
Figure  1 : Profil du signal


En utilisant des combinaisons de ces paramètres, il est possible de distinguer les doublets des singulets (figure 2). Cette méthodologie est aussi utilisée pour le tri cellulaire afin d'éviter la contamination du tri par des cellules non désirées. En effet, lors du tri, le cytomètre voit l'agrégat comme une seule cellule, si cet agrégat est constitué d'une cellule négative et d'une cellule positive, il sera vu comme une cellule positive. Si cet agrégat est trié comme tel, il y aura une cellule négative triée en même temps que la cellule positive aboutissant à une diminution de la pureté des cellules triées.


Elimination des doublets

Figure 2 : Principe d'élimination des doublets

Viabilité cellulaire

L'utilisation de marqueurs de l'ADN ne franchissant pas la barrière membranaire permet de déterminer très facilement le pourcentage de cellules vivantes/mortes. Les cellules mortes ayant des membranes altérées qui laissent passer le colorant deviennent fluorescentes (Figure 3).

Figure 3 : Marquage des cellules mortes par le Sytox

Lors de marquages sur des populations complexes ce type de marquage est important car les cellules mortes présentent très souvent des marquages non spécifiques qui peuvent fausser les résultats. Dans le cas du tri cellulaire, cela évite de trier des cellules mortes si l'on veut remettre la population triée en culture.

Evaluation de la quantité d'ADN

En perméabilisant les cellules, le marquage de l'ADN va permettre de quantifier la quantité présente au sein de la cellule. Attention toutefois, l'ARN double brin peut être aussi marqué par les intercalants et s'ajoutera à la mesure de l'ADN, pour éviter cela il faudra utiliser un tampon de marquage dégradant cet ARN (RNase). Il faut aussi que l'accessibilité de l'ADN au colorant soit optimisée. Il existe de très nombreux protocoles de marquage de l'ADN en fonction des types cellulaires, il conviendra de tester ses propres cellules avec plusieurs protocoles afin que la mesure soit optimisée.

Cette application est utilisée dans de nombreux domaines comme la recherche agronomique où il a été constaté par exemple que la quantité d'ADN de certaines plantes variait en fonction de l'altitude ou de leur situation géographique (plus l'altitude est élevée, plus il y a d'ADN, gradient de quantité d'ADN entre les caféiers de l'Afrique de l'ouest et l'Afrique de l'est) (Figure 4), en pisciculture où on a constaté que les males triploïdes présentaient de meilleurs rendements de croissance que leurs congénères diploides d'où la recherche de conditions d'élevage pour obtenir une majorité de males triploides (température, pH du milieu)...

Figure 4 : Mesure de la quantité d'ADN de plans de caféiers. En haut, plan contröle 2X et 3X. Au milieu mélange 2X et 3X. En bas mélange contrôle 3X et échantillon inconnu mesuré à 4X.

Le Cycle cellulaire

“Le cycle cellulaire représente l’intégralité de la période de division, c’est à dire l’ensemble des événements biochimiques et morphologiques qui sont responsables de la prolifération cellulaire”.
La mesure du cycle cellulaire par des méthodes classiques de CMF divise le cycle en trois phases: G0/G1, phase d’activation des cellules, S, phase de synthèse de l’ADN, G2/M phase de mitose (Figure 5 et 6). La distinction entre G0 (phase quiescente) et G1 (phase de préparation à la synthèse d’ADN) ainsi que G2 (préparation de la mitose) et M (mitose) est impossible avec une méthode utilisant un intercalant comme l’iodure de propidium.

Figure 5 : Les différentes phases du cycle cellulaire

Figure 6 : Evolution de la quantité d'ADN au cours du cycle


La CMF offre une méthodologie rapide et simple à mettre en oeuvre pour l’analyse du cycle cellulaire. Elle permet de suivre la distribution des cellules dans les différentes phases du cycle en fonction de divers stimuli ou de l’ajout de certaines drogues. Elle permet aussi de voir la présence de cellules avec des contenus anormaux d’ADN...
La plupart des applications qui concernent le cycle cellulaire n’utilisent qu’un seul paramètre, le contenu en ADN (figure 7). Des programmes mathématiques calculent les différentes phases du cycle. Les principales applications concernent la pharmacologie: étude de l’effet de drogues sur le cycle cellulaire, la cancérologie: pour déterminer la prolifération d’une tumeur et voir son contenu en ADN par rapport aux cellules normales.



Exemple de cycle cellulaire
Figure 7 : Analyse du cycle cellulaire d’une lignée tumorale.

Il existe d'autres méthodes d'évaluation du cycle cellulaire et qui permettent de calculer plus de paramètres du cycle cellulaire. Ces méthodes font appel à un marquage classique de l'ADN avec un intercalant mais on ajoute l'incorporation d'analogues de la thymidine. La technique au BrdU nécessite la mise en culture des cellules avec cet analogue (Figure 8) qui est incorporé lors de la phase de synthèse de l'ADN. Il faudra ensuite le révéler au moyen d'un anticorps spécifique capable de pénétrer dans le noyau pour se fixer au BrdU. Cette méthode nécessitait la dénaturation de l'ADN à l'acide chlorhydrique ce qui dénaturait les protéines et empéchait de fait de coupler le marquage du cycle avec un marqueur membranaire. Il existe maintenant une variante plus douce permettant d'étudier en plus les marqueurs par immunofluorescence (Carayon et al.). En jouant sur les temps d'incubation avec l'analogue à la thymidine on peut calculer des informations sur la cinétique du cycle cellulaire.

Figure 8 : Marquage du cycle cellulaire par le BrdU. En X, marquage à l'iodure de propidium, en Y marquage BrdU. A gauche, simple marquage IP, au milieu double marquage sur cellules standards, à droite, double marquage sur cellules bloquées en phase S

De nouvelles méthodes ne nécessitant pas de dénaturation de l'ADN sont apparues sur le marché comme la méthode ClickIt de chez ThermoFischer qui fait appel à un analogue de la thymidine modifié (EDU modifié). La révélation se fait sans dénaturation car la molécule de révélation est suffisamment petite pour aller se lier à l'EDUmodifié après fixation et perméabilisation par un détergent (Figure 9).

Figure 9: Marquage du cycle cellulaire par la technique ClickIt. A gauche le principe, à droite double marquage ClickIt (en Y) avec marqueur de l'ADN FxCycle (en X).

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