Cours de cytométrie

INTRODUCTION

Qu’est ce que la Cytométrie en flux?
C’est une technologie qui permet la mesure simultanée de plusieurs caractéristiques physiques d’une cellule.

Quelles sont les informations sur la cellule apportées par la cytométrie en flux (CMF)?
Sa taille relative (Forward Scatter),
Sa granularité ou sa complexité interne relative (Side Scatter),
Son intensité relative de fluorescence.

HISTORIQUE

Les méthodes d’analyse des cellules individuelles sont essentielles pour la compréhension des fonctions des cellules normales et la possibilité de modulation des cellules pathologiques. La cytométrie en flux (CMF) est née du besoin d’automatisation du comptage des constituants cellulaires du sang.
Les origines de la CMF sont anciennes puisque c’est en 1934 que Moldavan conçut le premier appareil avec lequel il réalisait des numérations cellulaires en faisant défiler les cellules dans un fin capillaire où elles étaient vues par un capteur photo électrique. Dans les années 70, les chercheurs de Los Alamos et de Stanford associaient des méthodes de mesure individuelle du volume ou de la fluorescence de cellules entraînées par un flux avec des méthodes électrostatiques permettant le tri cellulaire dans des conditions vitales. La diffusion de la lumière compléta rapidement la liste des propriétés capables de discriminer plusieurs types cellulaires. Le développement simultané d’appareillages commercialisés polyvalents et l’apparition des hybridomes pour la production d’anticorps monoclonaux a conduit à une explosion des activités impliquant la cytométrie en flux. L’utilisation des propriétés cellulaires intrinsèques (diffusion, auto fluorescence) et le développement permanent de fluorochromes capables de traduire de nombreuses propriétés et fonctions cellulaires ont conduit à la mise en oeuvre de méthodes de plus en plus fines pour l’analyse de populations de cellules hétérogènes.

DEFINITIONS

La CMF est définie comme l’étude précise de cellules isolées entraînées par un flux liquide. C’est une technique de caractérisation individuelle, quantitative et qualitative de particules en suspension dans un liquide.
Elle consiste à analyser les signaux optiques ou physiques émis par une particule coupant le faisceau lumineux d’un laser ou d’une lampe à arc. Les signaux mesurés sont essentiellement relatifs:
-aux propriétés optiques intrinsèques des particules qui correspondent aux phénomènes de diffusion lumineuse liés aux dimensions de la particule, à leur structure interne, ou à l’auto fluorescence de certaines cellules comme les végétaux, le phytoplancton...
-aux propriétés optiques induites de fluorescence obtenues par des marquages spécifiques de structures ou de fonctions cellulaires.
Ces signaux séparés par des filtres optiques sont collectés par des photomultiplicateurs, amplifiés, numérisés, traités et stockés par un ordinateur.
Ce procédé d’analyse individuelle (cellule par cellule) est multiparamètrique et peut s’effectuer à la vitesse de plusieurs milliers d’événements par seconde. L’ordinateur calcule les données statistiques associées aux distributions des paramètres mesuré et les représente sous la forme d’histogrammes (1 paramètre) ou de cytogrammes (2 paramètres) sur une ou plusieurs populations dont les propriétés cellulaires sont ainsi évaluées.
La fonction tri des cytomètres en flux les plus évolués permet de trier physiquement une ou deux populations cellulaires définies par leurs propriétés optiques.

PRINCIPES TECHNIQUES DE LA CMF

Les principes de la cytométrie sont résumés dans la figure 1 et 2.

Figure 1 : Le principe de la cytométrie appliqué à l'armée

Figure 2 : Principe simplifié d'un cytomètre en flux

Pour fonctionner un cytométre en flux nécessite une combinaison de:
Fluidique: Pour introduire et canaliser les cellules,
Optique: Une source d’excitation et de récupération des signaux,
Electronique: Pour convertir les signaux optiques en des signaux électroniques proportionnels et les numériser pour les analyser avec un ordinateur.

LES ECHANTILLONS CELLULAIRES

Les cellules doivent être mises en suspension pour pouvoir être analysées. L’analyse du sang ne pose aucun problème les cellules étant déjà en suspension. Par contre les tissus cellulaires doivent être dissociés et les agrégats éliminés afin de pouvoir être analysés.

LE CENTRAGE HYDRODYNAMIQUE

Les cellules sont amenées au centre de la buse de mesure et alignées les unes derrière les autres (au moyen du sytème de centrage hydrodynamique de l’échantillon) afin d’être excitées une par une avec le faisceau lumineux. Le liquide de gaine subit une accélération progressive ce qui entraîne un étirement du liquide échantillon et ainsi aligne les cellules au centre du jet (Figure 3).

Figure 3 : Principe du centrage hydrodynamique

CIRCUITS OPTIQUES

La source d’excitation lumineuse doit permettre une illumination des colorants à une longueur d’onde proche de leur maximum d’absorption. Elle doit être puissante, stable et nécessite une bonne focalisation.
Deux types de sources sont actuellement utilisées:
•Les lasers (les plus fréquemment utilisés) qui présentent un grand nombre d’avantages: puissance, stabilité, finesse du faisceau. Les lasers ont des spectres d’émission discontinus (Figure 4).

Figure 4 : principales sources lumineuses utilisées en cytométrie en flux

Les lasers à ions d’argon permettent d’exciter entre autres la fluorescéine, la phycoérythrine, l’iodure de propidium à 488 nm ainsi que dans l’U.V. pour des colorants comme le Hoechst 33342.
La présence de plusieurs lasers de type différents permet de multiplier le nombre de fluorochromes aux caractéristiques spectrales différentes.
•Les lampes à vapeur de mercure ou au xénon sont aussi utilisées. La focalisation est moindre que dans le cas du laser, mais le spectre est assez large et leur coût est limité.

COLLECTE DE LA LUMIERE EMISE

Les différents signaux optiques émis par la cellule doivent être focalisés, séparés, puis acheminés vers des systèmes de détection, photomultiplicateurs ou photodiodes. Ils sont pour cela, sélectionnés par différents circuits optiques, composés d’une alternance de miroirs et de filtres.
Un miroir est une surface réfléchissante. Suivant le traitement de sa surface, on peut obtenir trois types de miroirs: passe-haut, passe-bas et passe bande (Figure 5, 6, 7). De plus, les longueurs d’onde réfléchies varient aussi avec l’angle formé par le rayon incident et la surface du filtre.

Il existe divers types de filtres optiques

Figure 5 : Les différents types de filtres utilisés en cytométrie (R: Réflection, : longueur d'onde)

Les types de filtres

Figure 6 : Les différents types de filtres utilisés en cytométrie

Si les longueurs d’onde non réfléchies sont transmises, on obtient ainsi des miroirs dichroïques.
Pour les filtres, on retrouve en transmission les mêmes courbes que pour les miroirs, par contre les longueurs d’onde non transmises ne sont pas réfléchies. Elles sont soit absorbées soit détruites.
Après avoir traversé cette succession de miroirs et de filtres, la lumière est recueillie et transformée en signal électrique par un photomultiplicateur ou une photodiode.

Figure 7 : Exemple de trajet optique dans un cytomètre en flux

LES SIGNAUX RECUEILLIS

Les signaux optiques recueillis ont une intensité corrélée avec des propriétés cellulaires (tableau 1).

PARAMETRE	SIGNIFICATION	UTILISATION
Diffusion de la lumière aux petits angles	Proportionnel au diamètre cellulaire	Identification morphologique des cellules
Diffusion de la lumière à angle droit	Proportionnel au contenu cellulaire	Identification morphologique des cellules
Fluorescences	Proportionnelles à l’intensité de marquage	Marqueurs cellulaires, ADN, ARN, fonctions cellulaires...

Tableau 1: Signification des principaux signaux obtenus en cytométrie en flux.

La lumière diffusée

La lumière diffusée renseigne sur la morphologie et la structure de la cellule. Si la diffusion de la lumière est mesurée dans l’axe du rayon incident, l’intensité du signal peut être corrélée avec la taille et la viabilité cellulaire.
Sous un angle de 90°, la mesure correspond à la structure intracellulaire de la cellule (réfringence du cytoplasme, morphologie, rapport nucléo-cytoplasmique). L’utilisation simultanée de ces deux paramètres permet de distinguer, dans un sang périphérique par exemple, les plaquettes, les lymphocytes, les monocytes et les polynucléaires (figure 8).

Figure 8: Utilisation de la double diffusion de la lumière pour distinguer les diverses sous populations sanguines (FSC: diffusion aux petits angles, SSC diffusion aux grands angles).

La lumière absorbée

Cette mesure évolue proportionnellement au diamètre de la cellule (supposée sphérique) et à l’indice d’absorption des constituants cellulaires.

La fluorescence émise

Cette fluorescence peut être spontanée, mais le plus souvent, elle est apportée à la cellule par un fluorochrome. Le fluorochrome absorbe l’énergie du LASER et réemet l’énergie absorbée par vibration et dissipation de chaleur, émission de photons d’une longueur d’onde plus élevée (Les caractéristiques des principaux fluorochromes utilisés en CMF sont résumées dans le Tableau 2):

Tableau 2: Caractéristiques des principaux fluorochromes utilisés en cytométrie. (*: longueur d’onde d’excitation, @: longueur d’onde d’émission).

- Fluorochromes à affinité propre pour un constituant cellulaire: par exemple pour les mesures d’ADN, d’ARN, de protéines, du pH, de calcium contenus dans la cellule.
- Fluorochromes couplés à un ligand spécifique. Cette spécificité peut être amenée par un couplage du fluorochrome à un anticorps ou un ligand spécifique d’un constituant cellulaire.
Nous avons donc:
-    Créé une zone d’illumination avec les optiques d’excitation,
-    Introduit une cellule dans l’instrument au moyen de la fluidique,
-    Fait passé précisément les cellules dans la zone d’illumination par centrage hydrodynamique,
-    Dirigé les signaux lumineux générés vers les détecteurs spécifiques au moyen de l’optique collectrice.
L’électronique va maintenant traiter les signaux pour qu’ils soient exploitables par l’opérateur.

CONVERSION DES SIGNAUX

Les signaux optiques sont convertis en signaux électriques par les photomultiplicateurs. Ces signaux électriques ont une valeur comprise le plus souvent entre 0 et 10 volts (signal analogique). L’ordinateur ne peut traiter ces données que si elles sont sous forme binaire (signal digital). Le rôle du convertisseur analogique-digital est de convertir, comme son nom l’indique, un signal analogique (valeur continue) en signal digital (valeur discontinue) assimilable par l’ordinateur. C’est à dire de transformer une valeur comprise entre 0 et 10 volts en une valeur binaire comprise entre 0 et 255 pour un convertisseur 8 bits (28) ou entre 0 et 1023 pour un convertisseur 10 bits (210) (figure 9).

Figure 9: Principe de fonctionnement d’un convertisseur

PRESENTATION DES RESULTATS

Les valeurs numériques issues des convertisseurs sont stockées par l’informatique et présentées sur les écrans des cytomètres sous deux formes :
•des histogrammes monoparamétriques où l’axe des abscisses représente l’intensité du signal analysé et l’axe des ordonnées le nombre de cellules (figure 10).
•des histogrammes biparamétriques ou cytogrammes présentant deux signaux simultanément.

Figure 10: Présentation des résultats en cytométrie en flux.

LE TRI CELLULAIRE

L’analyse multiparamètrique d’une suspension cellulaire hétérogène permet de définir des sous-populations qui peuvent être séparées physiquement de la population globale. Pour cela, des critères de séparation sont déterminés par l’utilisateur (définition des zones d’intérêt du tri) et toute cellule dont les caractéristiques seront comprises entre les valeurs choisies sera isolée.

Dans ce but, la veine liquide sera chargée électriquement, puis fractionnée en une succession de gouttelettes. La gouttelette contenant la cellule voulue est déviée en passant dans un champs électrostatique et récupérée dans un récipient collecteur. Si la cellule appartient à une sous-population non sélectionnée ou si la gouttelette formée ne contient pas de cellule, la veine liquide ne sera pas chargée et la gouttelette éliminée.

AVANTAGE ET LIMITES DE LA CMF

Ce qui distingue la CMF des autres techniques analytiques et préparatives est qu’elle réunit les cinq caractéristiques essentielles suivantes: analyse quantitative, sensibilité de détection, rapidité, analyse multiparamètrique cellule par cellule, tri.

ANALYSE QUANTITATIVE

C’est un atout majeur par rapport à la microscopie optique courante que de pouvoir quantifier les paramètres observés. En effet, au microscope, il est difficile de classer des cellules en plus de quatre catégories selon leur fluorescence: “négatives”, “faibles”, “moyennes”, “fortes”. Un cytomètre avec amplificateur logarithmique permet de quantifier rigoureusement chaque critère optique sur une gamme de 1 à 10000 unités arbitraires de fluorescence. Mais le nombre de paramètres intervenant dans toute analyse de CMF (réglages optiques, fluorochromes, marqueurs) impose, dans le cadre d’une quantification absolue, l’utilisation de standards calibrés (billes fluorescentes par exemple).

SENSIBILITE DE DETECTION

En immunofluorescence, il est possible de discerner du bruit de fond une population de cellules lymphoïdes portant environ 1000 déterminants antigéniques par cellule.

VITESSE DE TRAVAIL

La vitesse moyenne d’analyse d’un cytomètre est de 1000 cellules par seconde bien qu’il soit possible, sur les appareils modernes, d’analyser de manière fiable jusqu’à 10000 événements par seconde sur plusieurs paramètres. En quelques secondes, la signification statistique du comptage est bien supérieure à celle obtenue classiquement par un microscope optique, même pour une sous-population de cellules très minoritaires.

L’ANALYSE SIMULTANEE DE PLUSIEURS PARAMETRES

La CMF offre la possibilité de travailler simultanément sur plusieurs paramètres, ce qui permet de mesurer, par exemple, deux ou trois paramètres simultanés sur une population lymphocytaire du sang ou de la moelle. Aucune autre méthode, qu’elle soit physico-chimique (centrifugation en gradient, élutriation) ou immunologique (panning, colonnes, rosettes) n’offre cette polyvalence.

LE TRI

Les cellules peuvent être isolées avec des taux de pureté supérieurs à 99%. Ces cellules peuvent être remises en culture. Il ne faut pas pour autant oublier la relative lenteur du tri: pour obtenir 106 cellules d’une population représentant initialement 1% de la population de départ, il faudrait, à la vitesse théorique de 1000 cellules par seconde environ 30 heures de tri. La grande pureté des populations triées par CMF ne peut donc être obtenue qu’au prix d’une sérieuse limitation du nombre de cellules recueillies et d’une surveillance critique constante lors de la séparation.

PRINCIPALES APPLICATIONS

L’hématologie a été l’une des premières disciplines médicales à bénéficier des applications cliniques de la CMF. Certaines de ces applications sont maintenant utilisées régulièrement pour le diagnostic ou le suivi thérapeutique de différentes affections. Ces applications concernent aussi bien l’étude fonctionnelle de cellules saines que la mise en évidence du caractère pathologique des cellules analysées.

IMMUNOFLUORESCENCE POUR LA CARACTERISATION DES SOUS-POPULATIONS CELLULAIRES

L’association de l'immunofluorescence et de la cytométrie en flux (CMF) est devenue un élément essentiel dans l’étude des systèmes biologiques, surtout dans la discrimination entre cellules d’une population hétérogène. En effet, l’utilisation des anticorps monoclonaux (AcM), dirigés contre des composants membranaires spécifiques, permet de distinguer des sous-populations lymphocytaires. Ces dernières années, l’identification et la caractérisation des antigènes (Ag) de surface des lymphocytes a progressé très rapidement. Cependant, il n’existe pas d’AcM pouvant reconnaître à lui seul une cellule particulière pourvue de certaines fonctions. Cette limitation a conduit les utilisateurs de la technique d’immunofluorescence à passer des simples aux multiples marquages en utilisant des combinaisons d’AcM révélés par des fluorochromes différents.
Par rapport aux investigations initiales réalisées au microscope, la CMF apporte en plus la quantification à l’échelon cellulaire individuel du nombre de sites reconnus et la possibilité de trier ces cellules selon l’intensité de leur marquage en vue d’études fonctionnelles ultérieures. Enfin elle peut se combiner à l’analyse d’autres paramètres (cycle cellulaire, Calcium) et donc nous informer sur l’état fonctionnel des cellules.

Principes de l’immunofluorescence

Les méthodes d’immunofluorescence se répartissent en deux groupes:
Les réactions directes où l’AcM est directement couplé à un fluorochrome :

Les réactions indirectes où l’AcM est révélé par un second réactif couplé au fluorochrome :

Ces deux méthodes font appel à des réactifs fluorescents: les fluorochromes. Un exemple de spectres d’émission de fluorochromes utilisé en immunofluorescence est représenté figure 11.

Figure 11: Spectres d’émission des principaux fluorochromes utilisés en immunofluorescence.

Pour les marquages multiples plusieurs fluorochromes sont utilisés simultanément. Dans ce cas, il faut que:
-leurs longueurs d’onde d’excitation correspondent à la source lumineuse du cytométre (en général 488 nm pour les cytométres les plus courants),
-leurs longueurs d’onde d’émission soient suffisamment éloignées pour que leurs signaux soient analysés séparément.
L’obstacle majeur dans les analyses multiparamétriques est constitué par le chevauchement important des spectres d’émission des fluorochromes employés pour révéler les AcM.
L’introduction d’un second laser a permis de vaincre une telle interférence en rendant possible l’excitation de plusieurs fluorochromes à spectres d’excitation et d’émission bien distincts. Mais cette technique était trop lourde et complexe pour être couramment utilisée. En effet, les analyseurs du marché ne disposent que d’une seule source lumineuse.
Actuellement la nécessité d’un troisième marqueur pour caractériser les populations cellulaires a conduit à l’élaboration de nouveaux fluorochromes dont le principe de fonctionnement est basé sur le transfert d’énergie entre plusieurs constituants. Le premier colorant est excité à 488 nm, il réémet à sa longueur d’onde d’émission qui est la longueur d’onde d’excitation du second colorant.

Principes de la compensation de fluorescence

Les chevauchements des spectres d’émission des divers fluorochromes utilisés en cytométrie nécessite l’emploi de compensations électroniques de fluorescence afin de soustraire la superposition des deux signaux de fluorescence (figure 13).

Figure 13: Fuites de fluorescence.

Ainsi, sans compensation de fluorescence, une population cellulaire marquée en fluorescence verte (FITC) mais non marquée en fluorescence orange (PE) est positionnée sur la bissectrice de l’histogramme biparamétrique des deux fluorescences (figure 14a).
Le système de compensation permet de soustraire artificiellement la fluorescence orange qui résulte de la fuite de fluorescence du FITC dans le canal de la PE (figure 14b).

Chaque pourcentage de compensation sera ainsi déterminé par l’analyse des cellules simplement marquées par les divers colorants.

En cancérologie, la détection de la cellule pathologique est l’application la plus développée. Cette détection repose essentiellement sur la mesure d’un contenu anormal d’ADN dans le noyau de la cellule tumorale.

MARQUAGE SPECIFIQUE DE L’ADN POUR LA MESURE DU CYCLE CELLULAIRE

“Le cycle cellulaire représente l’intégralité de la période de division, c’est à dire l’ensemble des événements biochimiques et morphologiques qui sont responsables de la prolifération cellulaire”.
La mesure du cycle cellulaire par des méthodes classiques de CMF divise le cycle en trois phases: G0/G1, phase d’activation des cellules, S, phase de synthèse de l’ADN, G2/M phase de mitose. La distinction entre G0 (phase quiescente) et G1 (phase de préparation à la synthèse d’ADN) ainsi que G2 (préparation de la mitose) et M (mitose) est impossible avec une méthode utilisant un intercalant comme l’iodure de propidium.
La CMF offre une méthodologie rapide et simple à mettre en oeuvre pour l’analyse du cycle cellulaire. Elle permet de suivre la distribution des cellules dans les différentes phases du cycle en fonction de divers stimuli ou de l’ajout de certaines drogues. Elle permet aussi de voir la présence de cellules avec des contenus anormaux d’ADN...

Marquage spécifique de l’ADN

Il existe de nombreux colorants de l’ADN pour les études en CMF.
Le Hoechst est un dérivé de benzimidazole qui émet une fluorescence bleue quand il est excité dans l’UV. Il a une haute affinité pour l’ADN et se lie préférentiellement aux bases A-T, mais ce n’est pas un intercalant. Le DAPI présente les mêmes caractéristiques que le Hoechst et peut être interchangé avec lui.
La mithramycine, la chromomycine sont des antibiotiques excitables à 445nm et qui émettent à 575 nm (orange). Ils se lient aux régions G-C par des mécanismes non-intercalants.
L’iodure de propidium et le bromure d’éthidium sont les colorants les plus utilisés. Ces deux colorants sont des intercalants aussi bien des doubles brins d’ADN que d’ARN. Tous les deux sont excitables dans le bleu et émettent dans le rouge (615 nm).

Stœchiométrie de la coloration

Il est important que la fluorescence émise par la sonde soit proportionnelle à sa fixation sur l’ADN. Dans le cas contraire il n’est pas possible de mesurer un cycle cellulaire ou un contenu en ADN.
Les intercalants, bien que leur fixation soit liée à l’accessibilité de l’ADN, sont plus utilisés pour mesurer les contenus en ADN car la teneur en A-T et G-C n’intervient pas dans leur fixation.

Présentation des résultats

La plupart des applications qui concernent le cycle cellulaire n’utilisent qu’un seul paramètre, le contenu en ADN (figure 15). Des programmes mathématiques calculent les différentes phases du cycle. Les principales applications concernent la pharmacologie: étude de l’effet de drogues sur le cycle cellulaire, la cancérologie: pour déterminer la prolifération d’une tumeur et voir son contenu en ADN par rapport aux cellules normales.

Figure 15: Analyse du cycle cellulaire d’une lignée tumorale.

De nombreuses études en pharmacologie font aussi appel à des techniques de CMF: mise au point ou étude de drogues antimitotiques, immunothérapie.
D’autres recherches font appel à la CMF: l’analyse des chromosomes, la physiologie végétale (ploïdie, contenu en ADN, pour la sélection des plantes les plus résistantes), l’océanographie...