LA CYTOMETRIE EN FLUX


Christophe Duperray

MRI-Cytométrie-IRB
Institute For Regenerative Medicine and Biotherapy
Hôpital St Eloi
CHU de Montpellier
80, Av. Augustin Fliche
34295 Montpellier Cedex 5





  1. INTRODUCTION
  2. HISTORIQUE
  3. DEFINITIONS
  4. PRINCIPES TECHNIQUES DE LA CMF
    1. LES ECHANTILLONS CELLULAIRES
    2. LE CENTRAGE HYDRODYNAMIQUE
    3. CIRCUITS OPTIQUES
    4. COLLECTE DE LA LUMIERE EMISE
    5. LES SIGNAUX RECUEILLIS
      1. La lumière diffusée
      2. La fluorescence émise
    6. CONVERSION DES SIGNAUX
    7. PRESENTATION DES RESULTATS
  5. LE TRI CELLULAIRE
  6. AVANTAGE ET LIMITES DE LA CMF
    1. ANALYSE QUANTITATIVE
    2. SENSIBILITE DE DETECTION
    3. VITESSE DE TRAVAIL
    4. L’ANALYSE SIMULTANEE DE PLUSIEURS PARAMETRES
    5. LE TRI
  7. PRINCIPALES APPLICATIONS
    1. IMMUNOFLUORESCENCE POUR LA CARACTERISATION DES SOUS-POPULATIONS CELLULAIRES
      1. Principes de l’immunofluorescence
      2. Principes de la compensation de fluorescence
      3. Détermination du seuil de positivité
    2. MARQUAGE SPECIFIQUE DE L’ADN POUR LA MESURE DU CYCLE CELLULAIRE
      1. Marquage spécifique de l’ADN
      2. St½chiométrie de la coloration
      3. Elimination des doublets
      4. Présentation des résultats


INTRODUCTION

Qu'est ce que la Cytométrie en flux?
C'est une technologie qui permet la mesure simultanée de plusieurs caractéristiques physiques d'une particule (cellule) en suspension.

Quelles sont les informations sur la cellule apportées par la cytométrie en flux (CMF)?
Sa taille relative (Forward Scatter),
Sa granularité ou sa complexité interne relative (Side Scatter),
Son intensité relative de fluorescence.

HISTORIQUE

Les méthodes d’analyse des cellules individuelles sont essentielles pour la compréhension des fonctions des cellules normales et la possibilité de modulation des cellules pathologiques. La cytométrie en flux (CMF) est née du besoin d’automatisation du comptage des constituants cellulaires du sang.
Les origines de la CMF sont anciennes puisque c’est en 1934 que Moldavan conçut le premier appareil avec lequel il réalisait des numérations cellulaires en faisant défiler les cellules dans un fin capillaire où elles étaient vues par un capteur photo électrique. Dans les années 70, les chercheurs de Los Alamos et de Stanford associaient des méthodes de mesure individuelle du volume ou de la fluorescence de cellules entraînées par un flux avec des méthodes électrostatiques permettant le tri cellulaire dans des conditions vitales. La diffusion de la lumière compléta rapidement la liste des propriétés capables de discriminer plusieurs types cellulaires. Le développement simultané d’appareillages commercialisés polyvalents et l’apparition des hybridomes pour la production d’anticorps monoclonaux a conduit à une explosion des activités impliquant la cytométrie en flux. L’utilisation des propriétés cellulaires intrinsèques (diffusion, auto fluorescence) et le développement permanent de fluorochromes capables de traduire de nombreuses propriétés et fonctions cellulaires ont conduit à la mise en oeuvre de méthodes de plus en plus fines pour l’analyse de populations de cellules hétérogènes.

DEFINITIONS

La CMF est définie comme l’étude précise de cellules isolées entraînées par un flux liquide. C’est une technique de caractérisation individuelle, quantitative et qualitative de particules en suspension dans un liquide.
Elle consiste à analyser les signaux optiques ou physiques émis par une particule coupant le faisceau lumineux d’un laser ou d’une lampe à arc. Les signaux mesurés sont essentiellement relatifs:
-aux propriétés optiques intrinsèques des particules qui correspondent aux phénomènes de diffusion lumineuse liés aux dimensions de la particule, à leur structure interne, ou à l’auto fluorescence de certaines cellules comme les végétaux, le phytoplancton...
-aux propriétés optiques induites de fluorescence obtenues par des marquages spécifiques de structures ou de fonctions cellulaires.
Ces signaux séparés par des filtres optiques sont collectés par des photomultiplicateurs, amplifiés, numérisés, traités et stockés par un ordinateur.
Ce procédé d’analyse individuelle (cellule par cellule) est multiparamètrique et peut s’effectuer à la vitesse de plusieurs milliers d’événements par seconde. L’ordinateur calcule les données statistiques associées aux distributions des paramètres mesuré et les représente sous la forme d’histogrammes (1 paramètre) ou de cytogrammes (2 paramètres) sur une ou plusieurs populations dont les propriétés cellulaires sont ainsi évaluées.
La fonction tri des cytomètres en flux les plus évolués permet de trier physiquement plusieurs populations cellulaires définies par leurs propriétés optiques.

PRINCIPES TECHNIQUES DE LA CMF

Les principes de la cytométrie sont résumés dans la figure 2.



Principe simplifié d'un cytomètre en flux

Figure 2 : Principe simplifié d'un cytomètre en flux


Pour fonctionner un cytométre en flux nécessite une combinaison de:

Fluidique: Pour introduire et canaliser les cellules.

Optique: Une source d’excitation et de récupération des signaux,

Electronique: Pour convertir les signaux optiques en des signaux électroniques proportionnels et les numériser pour les analyser avec un ordinateur.

LES ECHANTILLONS CELLULAIRES

Les cellules doivent être mises en suspension pour pouvoir être analysées. L’analyse du sang ne pose aucun problème les cellules étant déjà en suspension. Par contre les tissus cellulaires doivent être dissociés et les agrégats éliminés afin de pouvoir être analysés.

LE CENTRAGE HYDRODYNAMIQUE

Imaginez devoir compter, sur une autoroute avec de très nombreuses voies, les vehicules de différentes couleurs (Figure 3). Si la circulation est chargée et toutes les voies utilisées, il vous sera impossible d'effectuer cette tâche. Pour y parvenir, vous devez canaliser les vehicules sur une seule voie et, ainsi, il vous sera possible d'effectuer une analyse précise du nombre de véhicules de chaque couleur.

Autoroute

Dans un cytomètre en flux il faut procéder de la même façon. Les cellules sont amenées au centre de la buse de mesure et alignées les unes derrière les autres (au moyen du sytème de centrage hydrodynamique de l’échantillon) afin d’être excitées une par une avec le faisceau lumineux. Le liquide de gaine subit une accélération progressive ce qui entraîne un étirement du liquide échantillon et ainsi aligne les cellules au centre du jet (Figure 4).
Centrage hydrodynamique

Figure  4 : Principe du centrage hydrodynamique

Attention toutefois, lorsque l'échantillon de départ est faiblement concentré, l'utilisateur d'un cytomètre a tendance à augmenter la pression sur celui-ci afin de diminuer le temps d'acquisition. Malheureusement, cela a pour effet de diminuer la précision du centrage de l'échantillon et entraine une dispersion des mesures puisque les cellules ne passeront pas nécessairement dans la zone de focalisation de la source lumineuse (Figure 5). Cela est facilement visualisé en passant des billes de calibration à différentes pressions, leur pic s'élargit au fur et à mesure de l'augmentation de pression (augmentation du coefficient de variation). Cet effet est particulièrement préjudiciable aux mesures de cycle cellulaire où la finesse des pics est un gage de qualité de la mesure. Il est donc préférable d'augmenter la concentration de l'échantillon plutôt que d'augmenter la pression sur celui-ci. Bien évidemment, il faut aussi tenir compte des limites de traitement des informations de l'appareil. De même en augmentant trop la vitesse, on peut se retrouver dans le cas de figure où plusieurs particules passent au même moment devant la source lumineuse comprométant la fiabilité des mesures.

Vitesse d'analyse

Figure 5 : Effet de l'augmentation de pression sur l'échantillon sur la mesure du signal



CIRCUITS OPTIQUES

La source d’excitation lumineuse doit permettre une illumination des colorants à une longueur d’onde proche de leur maximum d’absorption. Elle doit être puissante, stable et nécessite une bonne focalisation.
Deux types de sources sont actuellement utilisées:
•Les lasers (les plus fréquemment utilisés) qui présentent un grand nombre d’avantages: puissance, stabilité, finesse du faisceau. Les lasers ont des spectres d’émission discontinus (Figure 5).
Source lumineuse

Figure 5 : principales sources lumineuses utilisées en cytométrie en flux


Les lasers à ions d'argon sont maintenant remplacés par des diodes laser nécessitant des contraintes d'installation moindres:

Laser IonDiode laser


La présence de plusieurs lasers de type différents permet de multiplier le nombre de fluorochromes aux caractéristiques spectrales différentes.
•Les lampes à vapeur de mercure ou au xénon étaient aussi utilisées. La focalisation est moindre que dans le cas du laser, mais le spectre est assez large et leur coût est limité.

Quand il y a plusieurs lasers au sein d'un cytomètre, ceux-ci peuvent être disposés de 2 façons. Soit ils sont tous focalisés au même endroit, on dit alors qu'ils sont colinéaires, soit ils sont décalés dans l'espace (la cellule passe successivement devant chaque laser) on dit alors qu'ils sont décalés.
L'intérêt des lasers décalés est qu'il permet, pour des fluorochromes ayant des longueurs d'ondes d'excitation différentes mais présentant des longueurs d'onde d'émission équivalentes d'être mesurés indépendamment ce qui n'est pas possible avec des lasers colinéaires (Figure 6). Les lasers colinéaires entrainent donc des contraintes plus importantes dans le choix des fluorochromes.


Configuration des Lasers

Figure 6 : Configuration des lasers,  décalés et colinéaires, exemple du 7AAD et de l'APC

COLLECTE DE LA LUMIERE EMISE

Les différents signaux optiques émis par la cellule doivent être focalisés, séparés, puis acheminés vers des systèmes de détection, photomultiplicateurs ou photodiodes. Ils sont pour cela, sélectionnés par différents circuits optiques, composés d’une alternance de miroirs et de filtres.
Un miroir est une surface réfléchissante. Suivant le traitement de sa surface, on peut obtenir trois types de miroirs: passe-haut, passe-bas et passe bande (Figure 7, 8). De plus, les longueurs d’onde réfléchies varient aussi avec l’angle formé par le rayon incident et la surface du filtre.


Il existe divers types de filtres optiques

Figure 7 : Les différents types de filtres utilisés en cytométrie (R: Réflection,  : longueur d'onde)


Les types de filtres
Figure 8 : Les différents types de filtres utilisés en cytométrie



Si les longueurs d'onde non réfléchies sont transmises, on obtient ainsi des miroirs dichroïques.
Pour les filtres, on retrouve en transmission les mêmes courbes que pour les miroirs, par contre les longueurs d'onde non transmises ne sont pas réfléchies. Elles sont soit absorbées soit détruites.
Après avoir traversé cette succession de miroirs et de filtres, la lumière est recueillie et transformée en signal électrique par un photomultiplicateur ou une photodiode (Figure 9).


Trajet optique
Figure 9 : Exemple de trajet optique dans un cytomètre en flux (©Becton Dickinson)


LES SIGNAUX RECUEILLIS

Les signaux optiques recueillis ont une intensité corrélée avec des propriétés cellulaires (tableau 1).

PARAMETRE SIGNIFICATION UTILISATION
Diffusion de la lumière aux petits angles Proportionnel au diamètre cellulaire Identification morphologique des cellules
Diffusion de la lumière à angle droit Proportionnel au contenu cellulaire Identification morphologique des cellules
Fluorescences Proportionnelles à l’intensité de marquage Marqueurs cellulaires, ADN, ARN, fonctions cellulaires...

Tableau 1:    Signification des principaux signaux obtenus en cytométrie en flux.

La lumière diffusée

La lumière diffusée renseigne sur la morphologie et la structure de la cellule:

Si la diffusion de la lumière est mesurée dans l’axe du rayon incident, l’intensité du signal peut être corrélée avec la taille et la viabilité cellulaire.

Sous un angle de 90°, la mesure correspond à la structure intracellulaire de la cellule (réfringence du cytoplasme, morphologie, rapport nucléo-cytoplasmique).

L’utilisation simultanée de ces deux paramètres permet de distinguer, dans un sang périphérique par exemple, les plaquettes, les lymphocytes, les monocytes et les polynucléaires (figure 10).


Diffusion de la lumière

Figure 10 : Utilisation de la double diffusion de la lumière pour distinguer les diverses sous populations sanguines (FSC: diffusion aux petits angles, SSC diffusion aux grands angles).


La fluorescence émise

Cette fluorescence peut être spontanée, mais le plus souvent, elle est apportée à la cellule par un fluorochrome. Le fluorochrome absorbe l’énergie du LASER et réemet l’énergie absorbée par vibration et dissipation de chaleur, émission de photons d’une longueur d’onde plus élevée (Les caractéristiques de quelques fluorochromes utilisés en CMF sont résumées dans le Tableau 2):




FLUOROCHROME
PROPRIETE
Excitation Max*
Emission Max@
Hoechst 33342
ADN (A-T)
365
402
DAPI
ADN (A-T)
357
451
Chromomycine A3
ADN (G-C)
450
470
Iodure de Propidium
ADN (intercalant)
536
620
Acridine Orange
ARN/ADN
492
527 db/630 sbrin
Alexa 488
Conjugaison
498
520
FITC
Conjugaison 490
543
PE
Conjugaison 490/565
578
PerCP
Conjugaison 488
675
APC
Conjugaison 642
660
PE-Cy5.5
Conjugaison 490/565 693
PE-Cy7
Conjugaison 490/565 778
Brilliant Violet 510
Conjugaison 405
510
Brilliant Violet 650 Conjugaison 405
650
GFP Gene Reporter 488 510
mCherry Gene Reporter 585
610
dTomato
Gene Reporter 554
580
Rhodamine 123
potentiel mitochondrial
505
534
BCECF-AM
pH
440
530
SNARF-1
pH/traceur
488
580/630
CFSE
traceur
498
518
Cascade blue
traceur
399
423
Fura Red
Ca2+
450-500
660
Indo1-AM
Ca2+ 331
405/480
Fluo-3
Ca2+ 506
526

Tableau 2 : Caractéristiques de quelques fluorochromes utilisés en cytométrie. (*: longueur d'onde d'excitation, @: longueur d'onde d'émission).


Il existe
- des Fluorochromes à affinité propre pour un constituant cellulaire: par exemple pour les mesures d’ADN, d’ARN, de protéines, du pH, de calcium contenus dans la cellule.
- des Fluorochromes couplés à un ligand spécifique. Cette spécificité peut être amenée par un couplage du fluorochrome à un anticorps ou un ligand spécifique d’un constituant cellulaire.
Attention toutefois car les fluorochromes n'ont pas tous le même rendement de fluorescence et n'auront donc pas les mêmes capacités de détection. Pour le démontrer, il 'suffit' de coupler le même anticorps avec ces différents fluorochromes et de comparer l'intensité des marquages sur les mêmes cellules (Figure 11).

Sensibilité des Fluorochromes

Figure 11 : Etude de la sensibilité des fluorochromes par un marquage avec un anticorps CD8
(©Beckman Coulter : O Jaen)

Nous avons donc:
-    Créé une zone d’illumination avec les optiques d’excitation,
-    Introduit une cellule dans l’instrument au moyen de la fluidique,
-    Fait passé précisément les cellules dans la zone d’illumination par centrage hydrodynamique,
-    Dirigé les signaux lumineux générés vers les détecteurs spécifiques au moyen de l’optique collectrice.
L’électronique va maintenant traiter les signaux pour qu’ils soient exploitables par l’opérateur.

CONVERSION DES SIGNAUX

Les signaux optiques sont convertis en signaux électriques par les photomultiplicateurs. Ces signaux électriques ont une valeur comprise le plus souvent entre 0 et 10 volts (signal analogique). L’ordinateur ne peut traiter ces données que si elles sont sous forme binaire (signal digital). Le rôle du convertisseur analogique-digital est de convertir, comme son nom l’indique, un signal analogique (valeur continue) en signal digital (valeur discontinue) assimilable par l’ordinateur. C’est à dire de transformer une valeur comprise entre 0 et 10 volts en une valeur binaire comprise entre 0 et 255 pour un convertisseur 8 bits (28) ou entre 0 et 1023 pour un convertisseur 10 bits (210) (figure 12).


Conversion analogique digitale


Figure 112: Principe de fonctionnement d'un convertisseur


PRESENTATION DES RESULTATS

Les valeurs numériques issues des convertisseurs sont stockées par l’informatique et présentées sur les écrans des cytomètres sous deux formes :
•des histogrammes monoparamétriques où l’axe des abscisses représente l’intensité du signal analysé et l’axe des ordonnées le nombre de cellules (figure 13).

Construction d'un histogramme

Figure 13 : Obtention d'un histogramme monoparamétrique.





•des histogrammes biparamétriques ou cytogrammes présentant deux signaux simultanément (Figure 14).


Histogramme et cytogramme

Figure 14 : Présentation des résultats en cytométrie en flux.

LE TRI CELLULAIRE

L’analyse multiparamètrique d’une suspension cellulaire hétérogène permet de définir des sous-populations qui peuvent être séparées physiquement de la population globale. Pour cela, des critères de séparation sont déterminés par l’utilisateur (définition des zones d’intérêt du tri) et toute cellule dont les caractéristiques seront comprises entre les valeurs choisies sera isolée.

Dans ce but, la veine liquide sera chargée électriquement, puis fractionnée en une succession de gouttelettes. La gouttelette contenant la cellule voulue est déviée en passant dans un champs électrostatique et récupérée dans un récipient collecteur. Si la cellule appartient à une sous-population non sélectionnée ou si la gouttelette formée ne contient pas de cellule, la veine liquide ne sera pas chargée et la gouttelette éliminée.

AVANTAGE ET LIMITES DE LA CMF

Ce qui distingue la CMF des autres techniques analytiques et préparatives est qu’elle réunit les cinq caractéristiques essentielles suivantes: analyse quantitative, sensibilité de détection, rapidité, analyse multiparamètrique cellule par cellule, tri.

ANALYSE QUANTITATIVE

C’est un atout majeur par rapport à la microscopie optique courante que de pouvoir quantifier les paramètres observés. En effet, au microscope, il est difficile de classer des cellules en plus de quatre catégories selon leur fluorescence: “négatives”, “faibles”, “moyennes”, “fortes”. Un cytomètre avec amplificateur logarithmique permet de quantifier rigoureusement chaque critère optique sur une gamme de 1 à plusieurs millions d'unités arbitraires de fluorescence. Mais le nombre de paramètres intervenant dans toute analyse de CMF (réglages optiques, fluorochromes, marqueurs) impose, dans le cadre d’une quantification absolue, l’utilisation de standards calibrés (billes fluorescentes par exemple).

SENSIBILITE DE DETECTION

En immunofluorescence, il est possible de discerner du bruit de fond une population de cellules lymphoïdes portant environ 1000 déterminants antigéniques par cellule.

VITESSE DE TRAVAIL

La vitesse moyenne d'analyse d'un cytomètre est de 10 000 cellules par seconde bien qu'il soit possible, sur les appareils modernes, d'analyser de manière fiable jusqu'à 100 000 événements par seconde sur plusieurs paramètres. En quelques secondes, la signification statistique du comptage est bien supérieure à celle obtenue classiquement par un microscope optique, même pour une sous-population de cellules très minoritaires.

L’ANALYSE SIMULTANEE DE PLUSIEURS PARAMETRES

La CMF offre la possibilité de travailler simultanément sur plusieurs paramètres, ce qui permet de mesurer, par exemple, deux ou trois paramètres simultanés sur une population lymphocytaire du sang ou de la moelle. Aucune autre méthode, qu’elle soit physico-chimique (centrifugation en gradient, élutriation) ou immunologique (panning, colonnes, rosettes) n’offre cette polyvalence.

LE TRI

Les cellules peuvent être isolées avec des taux de pureté supérieurs à 99%. Ces cellules peuvent être remises en culture. Il ne faut pas pour autant oublier la relative lenteur du tri: pour obtenir 106  cellules d’une population représentant initialement 1% de la population de départ, il faudrait un temps long (9h15) si les cellules sont par exemple très fragiles alors qu'il ne faut qu'une heure et 10 minutes si elles sont petites et résistantes (Tableau 3). La grande pureté des populations triées par CMF ne peut donc être obtenue qu’au prix d’une sérieuse limitation du nombre de cellules recueillies et d’une surveillance critique constante lors de la séparation.


Diamètre de buse
130
100
85
70
Pression en Psi (1atm=14,7 Psi)
10
25
45
70
Fréquence (KHz)
11
34
49
90
Vitesse Maxi (cellules par seconde)
3000
7000
11000
24000
Cellules passées par heure en Millions
10,8
25,2
39,6
86,4
Temps pour trier 1million de cellules représentant 1% du total
(si efficience de tri à 100%)
9h15
4h
2h30
1h10


Tableau 3 : Les contraintes du tri: Le diamètre de la buse doit être supérieur de 3 à 5 fois la taille des cellules. Les cellules fragiles doivent être triées à basse pression.





PRINCIPALES APPLICATIONS

L’hématologie a été l’une des premières disciplines médicales à bénéficier des applications cliniques de la CMF. Certaines de ces applications sont maintenant utilisées régulièrement pour le diagnostic ou le suivi thérapeutique de différentes affections. Ces applications concernent aussi bien l’étude fonctionnelle de cellules saines que la mise en évidence du caractère pathologique des cellules analysées.

IMMUNOFLUORESCENCE POUR LA CARACTERISATION DES SOUS-POPULATIONS CELLULAIRES

L’association de l'immunofluorescence et de la cytométrie en flux (CMF) est devenue un élément essentiel dans l’étude des systèmes biologiques, surtout dans la discrimination entre cellules d’une population hétérogène. En effet, l’utilisation des anticorps monoclonaux (AcM), dirigés contre des composants spécifiques, permet de distinguer des sous-populations lymphocytaires. Ces dernières années, l’identification et la caractérisation des antigènes (Ag) de surface des lymphocytes a progressé très rapidement. Cependant, il n’existe pas d’AcM pouvant reconnaître à lui seul une cellule particulière pourvue de certaines fonctions. Cette limitation a conduit les utilisateurs de la technique d’immunofluorescence à passer des simples aux multiples marquages en utilisant des combinaisons d’AcM révélés par des fluorochromes différents.
Par rapport aux investigations initiales réalisées au microscope, la CMF apporte en plus la quantification à l’échelon cellulaire individuel du nombre de sites reconnus et la possibilité de trier ces cellules selon l’intensité de leur marquage en vue d’études fonctionnelles ultérieures. Enfin elle peut se combiner à l’analyse d’autres paramètres (cycle cellulaire, Calcium) et donc nous informer sur l’état fonctionnel des cellules.

Principes de l’immunofluorescence

Les méthodes d’immunofluorescence se répartissent en deux groupes:
Les réactions directes où l’AcM est directement couplé à un fluorochrome :


La fluorescence directe


Les réactions indirectes où l’AcM est révélé par un second réactif couplé au fluorochrome :


La fluorescence indirecte


Ces deux méthodes font appel à des réactifs fluorescents: les fluorochromes. Un exemple de spectres d’émission de fluorochromes utilisé en immunofluorescence est  représenté figure 15.

Spectres de fluorochromes

Figure 15 : Spectres d'émission de 3 fluorochromes utilisés en immunofluorescence.(© Becton Dickinson, Spectra Viewer)



Pour les marquages multiples plusieurs fluorochromes sont utilisés simultanément.
Dans ce cas, il faut que:

-leurs longueurs d’onde d’excitation correspondent aux sources lumineuses du cytomètre,

-leurs longueurs d’onde d’émission soient suffisamment éloignées pour que leurs signaux soient analysés séparément.

-les antigènes faiblement exprimés soient révélés par des fluorochromes à fort rendement et les antigènes fortement exprimés avec des fluorochromes à faible rendement.

-dans le cas d’une co-expression sur une cellule, utiliser des fluorochromes dont les spectres se chevauchent peu ou pas.

L’obstacle majeur dans les analyses multiparamétriques est constitué par le chevauchement important des spectres d’émission des fluorochromes employés pour révéler les AcM.
L'introduction de plusieurs lasers a permis de vaincre une telle interférence en rendant possible l’excitation de plusieurs fluorochromes à spectres d’excitation et d’émission bien distincts.
Pour faciliter le choix des fluorochromes, il existe de nombreux outils sur proposés par des sociétés privées pour vous faciliter la vie :
 Becton Dickinson, Thermo Fischer, BioLegend, Chroma...


Principes de la compensation de fluorescence

Les chevauchements des spectres d’émission des divers fluorochromes utilisés en cytométrie nécessite l’emploi de compensations électroniques de fluorescence afin de soustraire la superposition des deux signaux de fluorescence (figure 16).

Fuite de fluorescence

Figure 16 : Fuites de fluorescence.



Ainsi, sans compensation de fluorescence, une population cellulaire marquée en fluorescence verte (FITC) mais non marquée en fluorescence orange (PE) est positionnée sur la bissectrice de l’histogramme biparamétrique des deux fluorescences (figure 17a).
Le système de compensation permet de soustraire artificiellement la fluorescence orange qui résulte de la fuite de fluorescence du FITC dans le canal de la PE (figure 17b).



Compensation de fluorescence

Figure 17 : Effet de la compensation de fluorescence



Chaque pourcentage de compensation sera ainsi déterminé par l’analyse des cellules simplement marquées par les divers colorants. Il conviendra de régler correctement les cellules négatives (A) et ensuite d'ajuster la médiane sur y de la population positive sur x (B) de manière à ce qu'elle soit égale à celle sur y des cellules négatives (Figure 18).

Calcul de la compensation

Figure 18 : Méthode de calcul de la compensation de fluorescence :

La médiane de la population B sur l’axe Y doit être égale à la médiane de la population A sur ce même axe.


Détermination du seuil de positivité

La pratique courante pour déterminer un seuil de positivité consiste à utiliser le 'marquage' isotypique et de positionner un curseur au pied du pic des cellules négatives. Cette pratique n'est pas recommandée dans le cadre des marquages multiples. En effet, quand plus d’une fluorescence est présente et que la compensation est réglée, la valeur négative du marquage peut être plus grande que dans un tube non marqué. Pour pallier à ce problème il faut utiliser la méthode FMO (fluorescences minus one) qui consiste à consiste à marquer les cellules avec tous les marqueurs présents dans l’étude sauf celui d’intérêt (Figure 19).


FMO

Figure 19 : Positionnement du seuil de positivité, méthode FMO


En cancérologie, la détection de la cellule pathologique est l’application la plus développée. Cette détection repose essentiellement sur la mesure d’un contenu anormal d’ADN dans le noyau de la cellule tumorale.

MARQUAGE SPECIFIQUE DE L’ADN POUR LA MESURE DU CYCLE CELLULAIRE

“Le cycle cellulaire représente l’intégralité de la période de division, c’est à dire l’ensemble des événements biochimiques et morphologiques qui sont responsables de la prolifération cellulaire”.
La mesure du cycle cellulaire par des méthodes classiques de CMF divise le cycle en trois phases: G0/G1, phase d’activation des cellules, S, phase de synthèse de l’ADN, G2/M phase de mitose. La distinction entre G0 (phase quiescente) et G1 (phase de préparation à la synthèse d’ADN) ainsi que G2 (préparation de la mitose) et M (mitose) est impossible avec une méthode utilisant un intercalant comme l’iodure de propidium.
La CMF offre une méthodologie rapide et simple à mettre en oeuvre pour l’analyse du cycle cellulaire. Elle permet de suivre la distribution des cellules dans les différentes phases du cycle en fonction de divers stimuli ou de l’ajout de certaines drogues. Elle permet aussi de voir la présence de cellules avec des contenus anormaux d’ADN...

Marquage spécifique de l’ADN

Il existe de nombreux colorants de l’ADN pour les études en CMF.
Le Hoechst est un dérivé de benzimidazole qui émet une fluorescence bleue quand il est excité dans l’UV. Il a une haute affinité pour l’ADN et se lie préférentiellement aux bases A-T, mais ce n’est pas un intercalant. Le DAPI présente les mêmes caractéristiques que le Hoechst et peut être interchangé avec lui.
La mithramycine, la chromomycine sont des antibiotiques excitables à 445nm et qui émettent à 575 nm (orange). Ils se lient aux régions G-C par des mécanismes non-intercalants.
L’iodure de propidium et le bromure d’éthidium sont les colorants les plus utilisés. Ces deux colorants sont des intercalants aussi bien des doubles brins d’ADN que d’ARN. Tous les deux sont excitables dans le bleu et émettent dans le rouge (615 nm).

 St½chiométrie de la coloration

Il est important que la fluorescence émise par la sonde soit proportionnelle à sa fixation sur l’ADN. Dans le cas contraire il n’est pas possible de mesurer un cycle cellulaire ou un contenu en ADN.
Les intercalants, bien que leur fixation soit liée à l’accessibilité de l’ADN, sont plus utilisés pour mesurer les contenus en ADN car la teneur en A-T et G-C n’intervient pas dans leur fixation.

Elimination des doublets

La fiabilité des résultats des mesures de cycle cellulaire repose sur la possibilité de ne pas prendre en compte les agrégats cellulaires. En effet, comment distinger une cellule en G2M d'un agrégat de 2 cellules en G0/G1 puisqu'au final la quantité d'ADN mesurée sera la même.

La méthode utilisée repose sur la possibilité d'analyser le profil du signal recueilli, son aire, sa hauteur ou son temps de passage (temps de vol, time of flight, TOF, width selon la machine) (Figure 20).

Format Signal
Figure  20 : Profil du signal


En utilisant des combinaisons de ces paramêtres, il est possible de distinguer les doublets des singulets (figure 21). Cette méthodologie est aussi utilisée pour le tri cellulaire afin d'éviter la contamination du tri par des cellules non désirées.


Elimination des doublets

Figure 21 : Principe d'élimination des doublets

Présentation des résultats

La plupart des applications qui concernent le cycle cellulaire n’utilisent qu’un seul paramètre, le contenu en ADN (figure 22). Des programmes mathématiques calculent les différentes phases du cycle. Les principales applications concernent la pharmacologie: étude de l’effet de drogues sur le cycle cellulaire, la cancérologie: pour déterminer la prolifération d’une tumeur et voir son contenu en ADN par rapport aux cellules normales.


Exemple de cycle cellulaire
Figure 22 : Analyse du cycle cellulaire d’une lignée tumorale.



De nombreuses études en pharmacologie font aussi appel à des techniques de CMF: mise au point ou étude de drogues antimitotiques, immunothérapie.
D’autres recherches font appel à la CMF: l’analyse des chromosomes, la physiologie végétale (ploïdie, contenu en ADN, pour la sélection des plantes les plus résistantes), l’océanographie...