AVANTAGE ET LIMITES DE LA CMF

Ce qui distingue la CMF des autres techniques analytiques et préparatives est qu’elle réunit les cinq caractéristiques essentielles suivantes: analyse quantitative, sensibilité de détection, rapidité, analyse multiparamètrique cellule par cellule, tri.

ANALYSE QUANTITATIVE

C’est un atout majeur par rapport à la microscopie optique courante que de pouvoir quantifier les paramètres observés. En effet, au microscope, il est difficile de classer des cellules en plus de quatre catégories selon leur fluorescence: “négatives”, “faibles”, “moyennes”, “fortes”. Un cytomètre avec amplificateur logarithmique permet de quantifier rigoureusement chaque critère optique sur une gamme de 1 à plusieurs millions d'unités arbitraires de fluorescence. Mais le nombre de paramètres intervenant dans toute analyse de CMF (réglages optiques, fluorochromes, marqueurs) impose, dans le cadre d’une quantification absolue, l’utilisation de standards calibrés (billes fluorescentes par exemple).

SENSIBILITE DE DETECTION

En immunofluorescence, il est possible de discerner du bruit de fond une population de cellules lymphoïdes portant environ 1000 déterminants antigéniques par cellule.

VITESSE DE TRAVAIL

La vitesse moyenne d'analyse d'un cytomètre est de 10 000 cellules par seconde bien qu'il soit possible, sur les appareils modernes, d'analyser de manière fiable jusqu'à 100 000 événements par seconde sur plusieurs paramètres. En quelques secondes, la signification statistique du comptage est bien supérieure à celle obtenue classiquement par un microscope optique, même pour une sous-population de cellules très minoritaires.

L’ANALYSE SIMULTANEE DE PLUSIEURS PARAMETRES

La CMF offre la possibilité de travailler simultanément sur plusieurs paramètres, ce qui permet de mesurer, par exemple, deux ou trois paramètres simultanés sur une population lymphocytaire du sang ou de la moelle. Aucune autre méthode, qu’elle soit physico-chimique (centrifugation en gradient, élutriation) ou immunologique (panning, colonnes, rosettes) n’offre cette polyvalence.

LE TRI

Les cellules peuvent être isolées avec des taux de pureté supérieurs à 99%. Ces cellules peuvent être remises en culture. Il ne faut pas pour autant oublier la relative lenteur du tri: pour obtenir 106  cellules d’une population représentant initialement 1% de la population de départ, il faudrait un temps long (9h15) si les cellules sont par exemple très fragiles alors qu'il ne faut qu'une heure et 10 minutes si elles sont petites et résistantes (Tableau 3). La grande pureté des populations triées par CMF ne peut donc être obtenue qu’au prix d’une sérieuse limitation du nombre de cellules recueillies et d’une surveillance critique constante lors de la séparation.


Diamètre de buse
130
100
85
70
Pression en Psi (1atm=14,7 Psi)
10
25
45
70
Fréquence (KHz)
11
34
49
90
Vitesse Maxi (cellules par seconde)
3000
7000
11000
24000
Cellules passées par heure en Millions
10,8
25,2
39,6
86,4
Temps pour trier 1million de cellules représentant 1% du total
(si efficience de tri à 100%)
9h15
4h
2h30
1h10


Tableau 3 : Les contraintes du tri: Le diamètre de la buse doit être supérieur de 3 à 5 fois la taille des cellules. Les cellules fragiles doivent être triées à basse pression.


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