LE TRI CELLULAIRE
L’analyse multiparamètrique d’une
suspension cellulaire hétérogène permet de définir des sous-populations
qui peuvent être séparées physiquement de la population globale. Pour
cela, des critères de séparation sont déterminés par l’utilisateur
(définition des zones d’intérêt du tri) et toute cellule dont les
caractéristiques seront comprises entre les valeurs choisies sera isolée.
Figure
1 : Principe du tri cellulaire.
Dans ce but, la veine liquide sera chargée électriquement, puis
fractionnée en une succession de gouttelettes par mise en vibration de la
buse par un système piézo-électrique qui déterminera la fréquence de
formation des gouttelettes (Figure 1). La gouttelette contenant la cellule
voulue est déviée en passant dans un champs électrostatique et récupérée
dans un récipient collecteur. Si la cellule appartient à une
sous-population non sélectionnée ou si la gouttelette formée ne contient
pas de cellule, la veine liquide ne sera pas chargée et la gouttelette
éliminée. Le tri cellulaire nécessite une très grande stabilité du jet
formé pour garantir une pureté des populations récoltées.
Il est possible de trier, suivant les
appareils, de 1 à 6 populations différentes simultanément en tubes ou bien
de récupérer les cellules directement en plaques de culture (6, 12, 24, 96
puits...) (Figure 2). L'exemple de cellules avant tri et après tri est
montré dans la figure 3.
Figure
2 : Les différentes façons de trier (à gauche tri 4 voies+poubelle, à
droite tri en plaque 96 puits)
Figure 3: Tri d'une population
CD19+CD27+: Avant tri (en haut), Après tri (en bas)
Les limites du tri cellulaire :
Les cellules peuvent être isolées avec
des taux de pureté supérieurs à 99%. Ces cellules peuvent être remises
en culture. Il ne faut pas pour autant oublier la relative lenteur du
tri: pour obtenir 106 cellules d’une population
représentant initialement 1% de la population de départ, il faudrait un
temps relativement long (9h15) si les cellules sont par exemple très
fragiles alors qu'il ne faut qu'une heure et 10 minutes si elles sont
petites et résistantes (Tableau 3). La grande pureté des populations
triées par CMF ne peut donc être obtenue qu’au prix d’une sérieuse
limitation du nombre de cellules recueillies et d’une surveillance
critique constante lors de la séparation.
Diamètre
de buse
|
130
|
100
|
85
|
70
|
Pression
en Psi (1atm=14,7 Psi)
|
10
|
25
|
45
|
70
|
Fréquence
(KHz)
|
11
|
34
|
49
|
90
|
Vitesse
Maxi (cellules par seconde)
|
3000
|
7000
|
11000
|
24000
|
Cellules
passées par heure en Millions
|
10,8
|
25,2
|
39,6
|
86,4
|
Temps
pour trier 1million de cellules représentant 1% du total
(si efficience de tri à 100%)
|
9h15
|
4h
|
2h30
|
1h10
|
Tableau
3 : Les contraintes du tri: Le diamètre de la buse doit être
supérieur de 3 à 5 fois la taille des cellules. Les cellules
fragiles doivent être triées à basse pression.