PRINCIPES TECHNIQUES DE LA CMF

Les principes de la cytométrie sont résumés dans la figure 1.



Principe simplifié d'un cytomètre en flux

Figure 1 : Principe simplifié d'un cytomètre en flux


Pour fonctionner un cytométre en flux nécessite une combinaison de:

Fluidique: Pour introduire et canaliser les cellules.

Optique: Une source d’excitation et de récupération des signaux,

Electronique: Pour convertir les signaux optiques en des signaux électroniques proportionnels et les numériser pour les analyser avec un ordinateur.

LES ECHANTILLONS CELLULAIRES

Les cellules doivent être mises en suspension pour pouvoir être analysées. L’analyse du sang ne pose aucun problème les cellules étant déjà en suspension. Par contre les tissus cellulaires doivent être dissociés et les agrégats éliminés afin de pouvoir être analysés.

LE CENTRAGE HYDRODYNAMIQUE

Imaginez devoir compter, sur une autoroute avec de très nombreuses voies, les vehicules de différentes couleurs (Figure 2). Si la circulation est chargée et toutes les voies utilisées, il vous sera impossible d'effectuer cette tâche. Pour y parvenir, vous devez canaliser les vehicules sur une seule voie et, ainsi, il vous sera possible d'effectuer une analyse précise du nombre de véhicules de chaque couleur.

Autoroute
Figure 2 : Principe de comptage d'un cytomètre


Dans un cytomètre en flux il faut procéder de la même façon. Les cellules sont amenées au centre de la buse de mesure et alignées les unes derrière les autres (au moyen du sytème de centrage hydrodynamique de l’échantillon) afin d’être excitées une par une avec le faisceau lumineux. Le liquide de gaine subit une accélération progressive ce qui entraîne un étirement du liquide échantillon et ainsi aligne les cellules au centre du jet (Figure 3).
Centrage hydrodynamique

Figure  3 : Principe du centrage hydrodynamique

Attention, lorsque l'échantillon de départ est faiblement concentré, l'utilisateur d'un cytomètre a tendance à augmenter la pression sur celui-ci afin de diminuer le temps d'acquisition. Malheureusement, cela a pour effet de diminuer la précision du centrage de l'échantillon et entraine une dispersion des mesures puisque les cellules ne passeront pas nécessairement dans la zone de focalisation de la source lumineuse (Figure 4). Cela est facilement visualisé en passant des billes de calibration à différentes pressions, leur pic s'élargit au fur et à mesure de l'augmentation de pression (augmentation du coefficient de variation). Cet effet est particulièrement préjudiciable aux mesures de cycle cellulaire où la finesse des pics est un gage de qualité de la mesure. Il est donc préférable d'augmenter la concentration de l'échantillon plutôt que d'augmenter la pression sur celui-ci. Bien évidemment, il faut aussi tenir compte des limites de traitement des informations de l'appareil. De même en augmentant trop la vitesse, on peut se retrouver dans le cas de figure où plusieurs particules passent au même moment devant la source lumineuse comprométant la fiabilité des mesures.

Vitesse d'analyse

Figure 4 : Effet de l'augmentation de pression sur l'échantillon sur la mesure du signal



CIRCUITS OPTIQUES

La source d’excitation lumineuse doit permettre une illumination des colorants à une longueur d’onde proche de leur maximum d’absorption. Elle doit être puissante, stable et nécessite une bonne focalisation.
Deux types de sources sont actuellement utilisées:
•Les lasers (les plus fréquemment utilisés) qui présentent un grand nombre d’avantages: puissance, stabilité, finesse du faisceau. Les lasers ont des spectres d’émission discontinus (Figure 5).
Source lumineuse

Figure 5 : principales sources lumineuses utilisées en cytométrie en flux


Les lasers à ions d'argon sont maintenant remplacés par des diodes laser nécessitant des contraintes d'installation moindres:

Laser IonDiode laser


La présence de plusieurs lasers de type différents permet de multiplier le nombre de fluorochromes aux caractéristiques spectrales différentes.
Les lampes à vapeur de mercure ou au xénon étaient aussi utilisées. La focalisation est moindre que dans le cas du laser, mais le spectre est assez large et leur coût est limité.

Quand il y a plusieurs lasers au sein d'un cytomètre, ceux-ci peuvent être disposés de 2 façons. Soit ils sont tous focalisés au même endroit, on dit alors qu'ils sont colinéaires, soit ils sont décalés dans l'espace (la cellule passe successivement devant chaque laser) on dit alors qu'ils sont décalés.
L'intérêt des lasers décalés est qu'il permet, pour des fluorochromes ayant des longueurs d'ondes d'excitation différentes mais présentant des longueurs d'onde d'émission équivalentes d'être mesurés indépendamment ce qui n'est pas possible avec des lasers colinéaires (Figure 6). Les lasers colinéaires entrainent donc des contraintes plus importantes dans le choix des fluorochromes.


Configuration des Lasers

Figure 6 : Configuration des lasers,  décalés et colinéaires, exemple du 7AAD et de l'APC

COLLECTE DE LA LUMIERE EMISE

Les différents signaux optiques émis par la cellule doivent être focalisés, séparés, puis acheminés vers des systèmes de détection, photomultiplicateurs ou photodiodes. Ils sont pour cela, sélectionnés par différents circuits optiques, composés d’une alternance de miroirs et de filtres.
Un miroir est une surface réfléchissante. Suivant le traitement de sa surface, on peut obtenir trois types de miroirs: passe-haut, passe-bas et passe bande (Figure 7, 8). De plus, les longueurs d’onde réfléchies varient aussi avec l’angle formé par le rayon incident et la surface du filtre.


Il existe divers types de filtres optiques

Figure 7 : Les différents types de filtres utilisés en cytométrie (R: Réflection,  : longueur d'onde)


Les types de filtres
Figure 8 : Les différents types de filtres utilisés en cytométrie



Si les longueurs d'onde non réfléchies sont transmises, on obtient ainsi des miroirs dichroïques.
Pour les filtres, on retrouve en transmission les mêmes courbes que pour les miroirs, par contre les longueurs d'onde non transmises ne sont pas réfléchies. Elles sont soit absorbées soit détruites.
Après avoir traversé cette succession de miroirs et de filtres, la lumière est recueillie et transformée en signal électrique par un photomultiplicateur ou une photodiode (Figure 9).


Trajet optique
Figure 9 : Exemple de trajet optique dans un cytomètre en flux (©Becton Dickinson)


LES SIGNAUX RECUEILLIS

Les signaux optiques recueillis ont une intensité corrélée avec des propriétés cellulaires (tableau 1).

PARAMETRE SIGNIFICATION UTILISATION
Diffusion de la lumière aux petits angles Proportionnel au diamètre cellulaire Identification morphologique des cellules
Diffusion de la lumière à angle droit Proportionnel au contenu cellulaire Identification morphologique des cellules
Fluorescences Proportionnelles à l’intensité de marquage Marqueurs cellulaires, ADN, ARN, fonctions cellulaires...

Tableau 1:    Signification des principaux signaux obtenus en cytométrie en flux.

La lumière diffusée

La lumière diffusée renseigne sur la morphologie et la structure de la cellule:

Si la diffusion de la lumière est mesurée dans l’axe du rayon incident, l’intensité du signal peut être corrélée avec la taille et la viabilité cellulaire.

Sous un angle de 90°, la mesure correspond à la structure intracellulaire de la cellule (réfringence du cytoplasme, morphologie, rapport nucléo-cytoplasmique).

L’utilisation simultanée de ces deux paramètres permet de distinguer, dans un sang périphérique par exemple, les plaquettes, les lymphocytes, les monocytes et les polynucléaires (figure 10).


Diffusion de la lumière

Figure 10 : Utilisation de la double diffusion de la lumière pour distinguer les diverses sous populations sanguines (FSC: diffusion aux petits angles, SSC diffusion aux grands angles).

Le seuil

Le choix du seuil ou threshold permet d'éliminer de l'analyse les particules de valeurs inférieures au seuil choisi sur le paramètre choisi. Par exemple, un seuil sur la taille permettra d'éliminer les particules les plus petites et ainsi d'éviter de polluer le fichier d'acquisition avec celles-ci. Cela peut servir, par exemple, à éliminer les plaquettes ou globules rouges d'une acquisition sur des lymphocytes. Attention de ne pas choisir un seuil trop important sous peine de risquer de ne plus voir certaines populations cellulaires de taille intermédiaire ou même non fluorescentes si l'on choisit de mettre un seuil sur une fluorescence. Le seuil sur une fluorescence est utile pour analyser un cycle cellulaire puisqu'il permet d'éviter de mesurer des cellules  non fluorescentes ou des petits fragments d'ADN.




La fluorescence émise

Cette fluorescence peut être spontanée, mais le plus souvent, elle est apportée à la cellule par un fluorochrome. Le fluorochrome absorbe l’énergie du LASER et réemet l’énergie absorbée par vibration et dissipation de chaleur, émission de photons d’une longueur d’onde plus élevée (Les caractéristiques de quelques fluorochromes utilisés en CMF sont résumées dans le Tableau 2):


FLUOROCHROME
PROPRIETE
Excitation Max*
Emission Max@
Hoechst 33342
ADN (A-T)
365
402
DAPI
ADN (A-T)
357
451
Chromomycine A3
ADN (G-C)
450
470
Iodure de Propidium
ADN (intercalant)
536
620
Acridine Orange
ARN/ADN
492
527 db/630 sbrin
Alexa 488
Conjugaison
498
520
FITC
Conjugaison 490
543
PE
Conjugaison 490/565
578
PerCP
Conjugaison 488
675
APC
Conjugaison 642
660
PE-Cy5.5
Conjugaison 490/565 693
PE-Cy7
Conjugaison 490/565 778
Brilliant Violet 510
Conjugaison 405
510
Brilliant Violet 650 Conjugaison 405
650
GFP Gene Reporter 488 510
mCherry Gene Reporter 585
610
dTomato
Gene Reporter 554
580
Rhodamine 123
potentiel mitochondrial
505
534
BCECF-AM
pH
440
530
SNARF-1
pH/traceur
488
580/630
CFSE
traceur
498
518
Cascade blue
traceur
399
423
Fura Red
Ca2+
450-500
660
Indo1-AM
Ca2+ 331
405/480
Fluo-3
Ca2+ 506
526

Tableau 2 : Caractéristiques de quelques fluorochromes utilisés en cytométrie. (*: longueur d'onde d'excitation, @: longueur d'onde d'émission).


Il existe
- des Fluorochromes à affinité propre pour un constituant cellulaire: par exemple pour les mesures d’ADN, d’ARN, de protéines, du pH, de calcium contenus dans la cellule.
- des Fluorochromes couplés à un ligand spécifique. Cette spécificité peut être amenée par un couplage du fluorochrome à un anticorps ou un ligand spécifique d’un constituant cellulaire.
Attention car les fluorochromes n'ont pas tous le même rendement de fluorescence et n'auront donc pas les mêmes capacités de détection. Pour le démontrer, il 'suffit' de coupler le même anticorps avec différents fluorochromes et de comparer l'intensité des marquages sur les mêmes cellules (Figure 11).

Sensibilité des Fluorochromes

Figure 11 : Etude de la sensibilité des fluorochromes par un marquage avec un anticorps CD8
(©Beckman Coulter : O Jaen)

Nous avons donc:
-    Créé une zone d’illumination avec les optiques d’excitation,
-    Introduit une cellule dans l’instrument au moyen de la fluidique,
-    Fait passer précisément les cellules dans la zone d’illumination par centrage hydrodynamique,
-    Dirigé les signaux lumineux générés vers les détecteurs spécifiques au moyen de l’optique collectrice.
L’électronique va maintenant traiter les signaux pour qu’ils soient exploitables par l’opérateur.

CONVERSION DES SIGNAUX

Les signaux optiques sont convertis en signaux électriques par les photomultiplicateurs. Ces signaux électriques ont une valeur comprise le plus souvent entre 0 et 10 volts (signal analogique). L’ordinateur ne peut traiter ces données que si elles sont sous forme binaire (signal digital). Le rôle du convertisseur analogique-digital est de convertir, comme son nom l’indique, un signal analogique (valeur continue) en signal digital (valeur discontinue) assimilable par l’ordinateur. C’est à dire de transformer une valeur comprise entre 0 et 10 volts en une valeur binaire comprise entre 0 et 255 pour un convertisseur 8 bits (28) ou entre 0 et 1023 pour un convertisseur 10 bits (210) (figure 12).


Conversion analogique digitale


Figure 12: Principe de fonctionnement d'un convertisseur


PRESENTATION DES RESULTATS

Les valeurs numériques issues des convertisseurs sont stockées par l’informatique et présentées sur les écrans des cytomètres sous deux formes :
•des histogrammes monoparamétriques où l’axe des abscisses représente l’intensité du signal analysé et l’axe des ordonnées le nombre de cellules, les axes peuvent être linéaires ou logarithmiques(figure 13).

Construction d'un histogramme

Figure 13 : Obtention d'un histogramme monoparamétrique.





•des histogrammes biparamétriques ou cytogrammes présentant deux signaux simultanément (Figure 14).


Histogramme et cytogramme

Figure 14 : Présentation des résultats en cytométrie en flux.



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