Figure 1 : Principe simplifié d'un cytomètre en flux

Pour fonctionner un cytométre en flux nécessite une combinaison de:

Fluidique: Pour introduire et canaliser les cellules.

Optique: Une source d’excitation et de récupération des signaux,

Electronique: Pour convertir les signaux optiques en des signaux électroniques proportionnels et les numériser pour les analyser avec un ordinateur.

Les cellules doivent être mises en suspension pour pouvoir être analysées. L’analyse du sang ne pose aucun problème les cellules étant déjà en suspension. Par contre les tissus cellulaires doivent être dissociés et les agrégats éliminés afin de pouvoir être analysés.

Imaginez devoir compter, sur une autoroute avec de très nombreuses voies, les vehicules de différentes couleurs (Figure 2). Si la circulation est chargée et toutes les voies utilisées, il vous sera impossible d'effectuer cette tâche. Pour y parvenir, vous devez canaliser les vehicules sur une seule voie et, ainsi, il vous sera possible d'effectuer une analyse précise du nombre de véhicules de chaque couleur.


Dans un cytomètre en flux il faut procéder de la même façon. Les cellules sont amenées au centre de la buse de mesure et alignées les unes derrière les autres (au moyen du sytème de centrage hydrodynamique de l’échantillon) afin d’être excitées une par une avec le faisceau lumineux. Le liquide de gaine subit une accélération progressive ce qui entraîne un étirement du liquide échantillon et ainsi aligne les cellules au centre du jet (Figure 3).

Figure  3 : Principe du centrage hydrodynamique

Attention, lorsque l'échantillon de départ est faiblement concentré, l'utilisateur d'un cytomètre a tendance à augmenter la pression sur celui-ci afin de diminuer le temps d'acquisition. Malheureusement, cela a pour effet de diminuer la précision du centrage de l'échantillon et entraine une dispersion des mesures puisque les cellules ne passeront pas nécessairement dans la zone de focalisation de la source lumineuse (Figure 4). Cela est facilement visualisé en passant des billes de calibration à différentes pressions, leur pic s'élargit au fur et à mesure de l'augmentation de pression (augmentation du coefficient de variation). Cet effet est particulièrement préjudiciable aux mesures de cycle cellulaire où la finesse des pics est un gage de qualité de la mesure. Il est donc préférable d'augmenter la concentration de l'échantillon plutôt que d'augmenter la pression sur celui-ci. Bien évidemment, il faut aussi tenir compte des limites de traitement des informations de l'appareil. De même en augmentant trop la vitesse, on peut se retrouver dans le cas de figure où plusieurs particules passent au même moment devant la source lumineuse comprométant la fiabilité des mesures.

La source d’excitation lumineuse doit permettre une illumination des colorants à une longueur d’onde proche de leur maximum d’absorption. Elle doit être puissante, stable et nécessite une bonne focalisation.
Deux types de sources sont actuellement utilisées:
•Les lasers (les plus fréquemment utilisés) qui présentent un grand nombre d’avantages: puissance, stabilité, finesse du faisceau. Les lasers ont des spectres d’émission discontinus (Figure 5).

Figure 5 : principales sources lumineuses utilisées en cytométrie en flux

La présence de plusieurs lasers de type différents permet de multiplier le nombre de fluorochromes aux caractéristiques spectrales différentes.
Les lampes à vapeur de mercure ou au xénon étaient aussi utilisées. La focalisation est moindre que dans le cas du laser, mais le spectre est assez large et leur coût est limité.

Quand il y a plusieurs lasers au sein d'un cytomètre, ceux-ci peuvent être disposés de 2 façons. Soit ils sont tous focalisés au même endroit, on dit alors qu'ils sont colinéaires, soit ils sont décalés dans l'espace (la cellule passe successivement devant chaque laser) on dit alors qu'ils sont décalés.
L'intérêt des lasers décalés est qu'il permet, pour des fluorochromes ayant des longueurs d'ondes d'excitation différentes mais présentant des longueurs d'onde d'émission équivalentes d'être mesurés indépendamment ce qui n'est pas possible avec des lasers colinéaires (Figure 6). Les lasers colinéaires entrainent donc des contraintes plus importantes dans le choix des fluorochromes.

Les différents signaux optiques émis par la cellule doivent être focalisés, séparés, puis acheminés vers des systèmes de détection, photomultiplicateurs ou photodiodes. Ils sont pour cela, sélectionnés par différents circuits optiques, composés d’une alternance de miroirs et de filtres.
Un miroir est une surface réfléchissante. Suivant le traitement de sa surface, on peut obtenir trois types de miroirs: passe-haut, passe-bas et passe bande (Figure 7, 8). De plus, les longueurs d’onde réfléchies varient aussi avec l’angle formé par le rayon incident et la surface du filtre.

Figure 7 : Les différents types de filtres utilisés en cytométrie (R: Réflection,  : longueur d'onde)


Figure 8 : Les différents types de filtres utilisés en cytométrie

Si les longueurs d'onde non réfléchies sont transmises, on obtient ainsi des miroirs dichroïques.
Pour les filtres, on retrouve en transmission les mêmes courbes que pour les miroirs, par contre les longueurs d'onde non transmises ne sont pas réfléchies. Elles sont soit absorbées soit détruites.
Après avoir traversé cette succession de miroirs et de filtres, la lumière est recueillie et transformée en signal électrique par un photomultiplicateur ou une photodiode (Figure 9).

Figure 9 : Exemple de trajet optique dans un cytomètre en flux (©Becton Dickinson)

La lumière diffusée renseigne sur la morphologie et la structure de la cellule:

Si la diffusion de la lumière est mesurée dans l’axe du rayon incident, l’intensité du signal peut être corrélée avec la taille et la viabilité cellulaire.

Sous un angle de 90°, la mesure correspond à la structure intracellulaire de la cellule (réfringence du cytoplasme, morphologie, rapport nucléo-cytoplasmique).

L’utilisation simultanée de ces deux paramètres permet de distinguer, dans un sang périphérique par exemple, les plaquettes, les lymphocytes, les monocytes et les polynucléaires (figure 10).

Figure 10 : Utilisation de la double diffusion de la lumière pour distinguer les diverses sous populations sanguines (FSC: diffusion aux petits angles, SSC diffusion aux grands angles).

Cette fluorescence peut être spontanée, mais le plus souvent, elle est apportée à la cellule par un fluorochrome. Le fluorochrome absorbe l’énergie du LASER et réemet l’énergie absorbée par vibration et dissipation de chaleur, émission de photons d’une longueur d’onde plus élevée (Les caractéristiques de quelques fluorochromes utilisés en CMF sont résumées dans le Tableau 2):

FLUOROCHROME	PROPRIETE	Excitation Max*	Emission Max@
Hoechst 33342	ADN (A-T)	365	402
DAPI	ADN (A-T)	357	451
Chromomycine A3	ADN (G-C)	450	470
Iodure de Propidium	ADN (intercalant)	536	620
Acridine Orange	ARN/ADN	492	527 db/630 sbrin
Alexa 488	Conjugaison	498	520
FITC	Conjugaison	490	543
PE	Conjugaison	490/565	578
PerCP	Conjugaison	488	675
APC	Conjugaison	642	660
PE-Cy5.5	Conjugaison	490/565	693
PE-Cy7	Conjugaison	490/565	778
Brilliant Violet 510	Conjugaison	405	510
Brilliant Violet 650	Conjugaison	405	650
GFP	Gene Reporter	488	510
mCherry	Gene Reporter	585	610
dTomato	Gene Reporter	554	580
Rhodamine 123	potentiel mitochondrial	505	534
BCECF-AM	pH	440	530
SNARF-1	pH/traceur	488	580/630
CFSE	traceur	498	518
Cascade blue	traceur	399	423
Fura Red	Ca2+	450-500	660
Indo1-AM	Ca2+	331	405/480
Fluo-3	Ca2+	506	526

Tableau 2 : Caractéristiques de quelques fluorochromes utilisés en cytométrie. (*: longueur d'onde d'excitation, @: longueur d'onde d'émission).

Il existe
- des Fluorochromes à affinité propre pour un constituant cellulaire: par exemple pour les mesures d’ADN, d’ARN, de protéines, du pH, de calcium contenus dans la cellule.
- des Fluorochromes couplés à un ligand spécifique. Cette spécificité peut être amenée par un couplage du fluorochrome à un anticorps ou un ligand spécifique d’un constituant cellulaire.
Attention car les fluorochromes n'ont pas tous le même rendement de fluorescence et n'auront donc pas les mêmes capacités de détection. Pour le démontrer, il 'suffit' de coupler le même anticorps avec différents fluorochromes et de comparer l'intensité des marquages sur les mêmes cellules (Figure 11).


Nous avons donc:
-    Créé une zone d’illumination avec les optiques d’excitation,
-    Introduit une cellule dans l’instrument au moyen de la fluidique,
-    Fait passer précisément les cellules dans la zone d’illumination par centrage hydrodynamique,
-    Dirigé les signaux lumineux générés vers les détecteurs spécifiques au moyen de l’optique collectrice.
L’électronique va maintenant traiter les signaux pour qu’ils soient exploitables par l’opérateur.

Les signaux optiques sont convertis en signaux électriques par les photomultiplicateurs. Ces signaux électriques ont une valeur comprise le plus souvent entre 0 et 10 volts (signal analogique). L’ordinateur ne peut traiter ces données que si elles sont sous forme binaire (signal digital). Le rôle du convertisseur analogique-digital est de convertir, comme son nom l’indique, un signal analogique (valeur continue) en signal digital (valeur discontinue) assimilable par l’ordinateur. C’est à dire de transformer une valeur comprise entre 0 et 10 volts en une valeur binaire comprise entre 0 et 255 pour un convertisseur 8 bits (2⁸) ou entre 0 et 1023 pour un convertisseur 10 bits (2¹⁰) (figure 12).

Figure 12: Principe de fonctionnement d'un convertisseur

Les valeurs numériques issues des convertisseurs sont stockées par l’informatique et présentées sur les écrans des cytomètres sous deux formes :
•des histogrammes monoparamétriques où l’axe des abscisses représente l’intensité du signal analysé et l’axe des ordonnées le nombre de cellules, les axes peuvent être linéaires ou logarithmiques(figure 13).


•des histogrammes biparamétriques ou cytogrammes présentant deux signaux simultanément (Figure 14).

Figure 14 : Présentation des résultats en cytométrie en flux.