MESURE DE L'APOPTOSE

La mort cellulaire programmée (apoptose) est un processus actif d'auto-destruction cellulaire. La différence avec la nécrose est qu'elle ne déclenche pas d'inflammation tissulaire car dans un premier temps les membranes cellulaires ne sont pas détruites. La première caractéristique exploitée en cytométrie est que la cellule entrain d'apoptoser subit une fragmentation d'organites et notamment de l'ADN du noyau. Ces fragments d'ADN finiront par être libérés de la cellule dans les corps apoptotiques.

Une autre caractéristique des cellules apoptotiques exploitable facilement en cytométrie est qu'elles exposent, sur le feuillet externe de la membrane plasmique, de la phosphatidylsérine qui normalement est constitutif du feuillet interne de la membrane.

Toutes ces caractéristiques peuvent facilement être utilisées pour étudier l'apoptose par cytomètrie.

Mesure de la fragmentation de l'ADN.

Les noyaux étant dégradés activement perdent une partie de leur contenu en ADN, les fragments se retrouvant dans les corps apoptotiques. En facilitant la sortie de ces corps apoptotiques de la cellule et en marquant l'ADN avec un colorant spécifique comme l'iodure de propidium, la cytométrie permet de détecter d'un côté les cellules n'ayant pas encore dégradé leur ADN qui auront donc leur contenu normal en ADN et de l'autre les cellules ayant perdu leurs fragments d'ADN (cellules apoptotiques) qui présenteront une quantité moindre d'ADN (pic sub-G0/G1). Pour détecter ces différences il suffit d'utiliser une solution facilitant la sortie des corps apoptotiques de la cellule comme une solution (éthanol/eau à 75/25% protocole sur le Cytobase). Un exemple de ce type de marquage est présenté sur la figure 1.

Figure 1 : Détection de la fragmentation de l'ADN lors de l'apoptose (Pic sub G0/G1 dans M1).


Mesure par l'Annexine V

La cellule apoptotique présente précocement une inversion membranaire vis à vis de la phosphatidylsérine qui passe du côté interne de la membrane cellulaire lorsque la cellule est vivante à l'extérieur de la membrane quand la cellule entre en apoptose.

L'annexine V est une protéine ayant une forte affinité pour la phosphatidylsérine, celle-ci a pu être utilisée pour réaliser des tests de détection précoce de l'apoptose. En couplant l'Annexine V à un fluorochrome, la recherche de cellules apoptotiques par cytométrie  fut grandement facilitée. En testant les mêmes cellules qu'avec le test de fragmentation de l'ADN, la mesure de la présence des phospatidylsérines sur la membrane extérieure montre un plus grand pourcentage de cellules marquées Annexine V car la détection de l'apoptose est plus précoce avec cette technique (Figure 2).

Figure 2 : Mesure de l'apoptose par la détection des phosphatidylsérines sur la membrane cellulaire extérieure par l'Annexine 5

Analyse multiparamétrique de l'apoptose

L'apoptose étant un phénomène actif sur des cellules vivantes et les cellules vivantes présentant une intégrité membranaire, il est possible de distinguer les cellules mortes des cellules apoptotiques par le marquage avec un marqueur de l'ADN ne franchissant pas cette membrane plasmique (comme l'iodure de propidium, le 7AAD...).
Il est possible d'utiliser marquage multiparamétrique pour distinguer en même temps la viabilité cellulaire ainsi que la présence de phosphatidylsérine sur la membrane extérieure de la cellule.
En utilisant simultanément ces deux marqueurs il sera possible d'analyser plus finement l'état des cellules en distinguant les cellules vivantes des cellules apoptotiques précoces et des cellules en nécrose/apoptose tardive (Figure 3).

Figure 3: Analyse multiparamétrique de l'apoptose par l'expression membranaire de l'Annexine V (en Y) et le marquage des cellules mortes par le 7AAD (en X).

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