IMMUNOFLUORESCENCE POUR LA CARACTERISATION DES SOUS-POPULATIONS CELLULAIRES

L’hématologie a été l’une des premières disciplines médicales à bénéficier des applications cliniques de la CMF. Certaines de ces applications sont maintenant utilisées régulièrement pour le diagnostic ou le suivi thérapeutique de différentes affections. Ces applications concernent aussi bien l’étude fonctionnelle de cellules saines que la mise en évidence du caractère pathologique des cellules analysées.

L’association de l'immunofluorescence et de la cytométrie en flux (CMF) est devenue un élément essentiel dans l’étude des systèmes biologiques, surtout dans la discrimination entre cellules d’une population hétérogène. En effet, l’utilisation des anticorps monoclonaux (AcM), dirigés contre des composants spécifiques, permet de distinguer des sous-populations lymphocytaires. Ces dernières années, l’identification et la caractérisation des antigènes (Ag) de surface des lymphocytes a progressé très rapidement. Cependant, il n’existe pas d’AcM pouvant reconnaître à lui seul une cellule particulière pourvue de certaines fonctions. Cette limitation a conduit les utilisateurs de la technique d’immunofluorescence à passer des simples aux multiples marquages en utilisant des combinaisons d’AcM révélés par des fluorochromes différents.
Par rapport aux investigations initiales réalisées au microscope, la CMF apporte en plus la quantification à l’échelon cellulaire individuel du nombre de sites reconnus et la possibilité de trier ces cellules selon l’intensité de leur marquage en vue d’études fonctionnelles ultérieures. Enfin elle peut se combiner à l’analyse d’autres paramètres (cycle cellulaire, Calcium) et donc nous informer sur l’état fonctionnel des cellules.

Principes de l’immunofluorescence

Les méthodes d’immunofluorescence se répartissent en deux groupes:
Les réactions directes où l’AcM est directement couplé à un fluorochrome :


La fluorescence directe


Les réactions indirectes où l’AcM est révélé par un second réactif couplé au fluorochrome :


La fluorescence indirecte


Ces deux méthodes font appel à des réactifs fluorescents, des anticorps couplé à des fluorochromes. Un exemple de spectres d’émission de fluorochromes utilisé en immunofluorescence est  représenté figure 1.

Spectres de fluorochromes

Figure 1 : Spectres d'émission de 3 fluorochromes utilisés en immunofluorescence.(© Becton Dickinson, Spectra Viewer)



Pour les marquages multiples plusieurs fluorochromes sont utilisés simultanément.
Dans ce cas, il faut que:

-leurs longueurs d’onde d’excitation correspondent aux sources lumineuses du cytomètre,

-leurs longueurs d’onde d’émission soient suffisamment éloignées pour que leurs signaux soient analysés séparément.

-les antigènes faiblement exprimés soient révélés par des fluorochromes à fort rendement et les antigènes fortement exprimés avec des fluorochromes à faible rendement.

-dans le cas d’une co-expression sur une cellule, utiliser des fluorochromes dont les spectres se chevauchent peu ou pas.

L’obstacle majeur dans les analyses multiparamétriques est constitué par le chevauchement important des spectres d’émission des fluorochromes employés pour révéler les AcM.
L'introduction de plusieurs lasers dans les cytomètres a permis de vaincre une telle interférence en rendant possible l’excitation de plusieurs fluorochromes à spectres d’excitation et d’émission bien distincts.
Pour faciliter le choix des fluorochromes, il existe de nombreux outils sur proposés par des sociétés privées :
 Becton Dickinson, Thermo Fischer, BioLegend, Chroma...

Avant de démarrer tout protocole d'immuno-marquage il est important de vérifier la qualité des réactifs utilisés en testant ceux-ci sur des cellules dont on sait qu'elles présentent l'antigène analysé.
Il faut tester la concentration à laquelle le réactif est efficace en marquant ces cellules avec diverses concentrations du réactif et tracer une courbe de l'intensité de marquage en fonction de cette concentration (Figure 2):

Figure 2 : Effet de la concentration d'un anticorps sur sa capacité de marquage.

Principes de la compensation de fluorescence

Les chevauchements des spectres d’émission des divers fluorochromes utilisés en cytométrie nécessite l’emploi de compensations électroniques de fluorescence afin de soustraire la superposition des deux signaux de fluorescence (figure 3).

Fuite de fluorescence

Figure 3 : Fuites de fluorescence.



Ainsi, sans compensation de fluorescence, une population cellulaire marquée en fluorescence verte (FITC) mais non marquée en fluorescence orange (PE) est positionnée sur la bissectrice de l’histogramme biparamétrique des deux fluorescences (figure 4a).
Le système de compensation permet de soustraire artificiellement la fluorescence orange qui résulte de la fuite de fluorescence du FITC dans le canal de la PE (figure 4b).



Compensation de fluorescence

Figure 4 : Effet de la compensation de fluorescence



Chaque pourcentage de compensation sera ainsi déterminé par l’analyse des cellules simplement marquées par les divers colorants. Il conviendra de régler correctement les cellules négatives (A) et ensuite d'ajuster la médiane sur y de la population positive sur x (B) de manière à ce qu'elle soit égale à celle sur y des cellules négatives (Figure 5).

Calcul de la compensation

Figure 5 : Méthode de calcul de la compensation de fluorescence :

La médiane de la population B sur l’axe Y doit être égale à la médiane de la population A sur ce même axe.


Détermination du seuil de positivité

La pratique courante pour déterminer un seuil de positivité consiste à utiliser le 'marquage' isotypique et de positionner un curseur au pied du pic des cellules négatives. Cette pratique n'est pas recommandée dans le cadre des marquages multiples. En effet, quand plus d’une fluorescence est présente et que la compensation est réglée, la valeur négative du marquage peut être plus grande que dans un tube non marqué. Pour pallier à ce problème il faut utiliser la méthode FMO (fluorescences minus one) qui consiste à consiste à marquer les cellules avec tous les marqueurs présents dans l’étude sauf celui d’intérêt (Figure 6).


FMO

Figure 6 : Positionnement du seuil de positivité, méthode FMO

Une fois tous les contrôles et réglages effectués, les analyses en immunofluorescences peuvent être menées comme par exemple la recherche de cellules tumorales dans la moelle de patients atteints de Myélome Multiple (Figure 7)
Figure 7 : Multimarquage pour le suivi des cellules tumorales dans la moelle de patients atteints de myélome multiple



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