IMMUNOFLUORESCENCE POUR LA CARACTERISATION DES SOUS-POPULATIONS
CELLULAIRES
L’hématologie a été l’une des premières
disciplines médicales à bénéficier des applications cliniques de la CMF.
Certaines de ces applications sont maintenant utilisées régulièrement pour
le diagnostic ou le suivi thérapeutique de différentes affections. Ces
applications concernent aussi bien l’étude fonctionnelle de cellules
saines que la mise en évidence du caractère pathologique des cellules
analysées.
L’association de l'immunofluorescence et
de la cytométrie en flux (CMF) est devenue un élément essentiel dans
l’étude des systèmes biologiques, surtout dans la discrimination entre
cellules d’une population hétérogène. En effet, l’utilisation des
anticorps monoclonaux (AcM), dirigés contre des composants spécifiques,
permet de distinguer des sous-populations lymphocytaires. Ces dernières
années, l’identification et la caractérisation des antigènes (Ag) de
surface des lymphocytes a progressé très rapidement. Cependant, il
n’existe pas d’AcM pouvant reconnaître à lui seul une cellule particulière
pourvue de certaines fonctions. Cette limitation a conduit les
utilisateurs de la technique d’immunofluorescence à passer des simples aux
multiples marquages en utilisant des combinaisons d’AcM révélés par des
fluorochromes différents.
Par rapport aux investigations initiales réalisées au microscope, la CMF
apporte en plus la quantification à l’échelon cellulaire individuel du
nombre de sites reconnus et la possibilité de trier ces cellules selon
l’intensité de leur marquage en vue d’études fonctionnelles ultérieures.
Enfin elle peut se combiner à l’analyse d’autres paramètres (cycle
cellulaire, Calcium) et donc nous informer sur l’état fonctionnel des
cellules.
Principes de l’immunofluorescence
Les méthodes d’immunofluorescence se répartissent en deux groupes:
Les réactions directes où l’AcM est directement couplé à un fluorochrome :
Les réactions indirectes où l’AcM est révélé par un second réactif couplé au
fluorochrome :
Ces deux méthodes font appel à des
réactifs fluorescents, des anticorps couplé à des fluorochromes. Un
exemple de spectres d’émission de fluorochromes utilisé en
immunofluorescence est représenté figure 1.
Figure 1 :
Spectres d'émission de 3 fluorochromes utilisés en immunofluorescence.(© Becton
Dickinson, Spectra Viewer)
Pour les marquages multiples plusieurs
fluorochromes sont utilisés simultanément.
Dans ce cas, il faut que:
-leurs longueurs d’onde d’excitation correspondent aux sources lumineuses
du cytomètre,
-leurs longueurs d’onde d’émission soient suffisamment éloignées pour que
leurs signaux soient analysés séparément.
-les antigènes faiblement exprimés soient révélés par des fluorochromes à
fort rendement et les antigènes fortement exprimés avec des fluorochromes
à faible rendement.
-dans le cas d’une co-expression sur une cellule, utiliser des
fluorochromes dont les spectres se chevauchent peu ou pas.
L’obstacle majeur dans les analyses multiparamétriques est constitué par
le chevauchement important des spectres d’émission des fluorochromes
employés pour révéler les AcM.
L'introduction de plusieurs lasers dans les cytomètres a permis de vaincre
une telle interférence en rendant possible l’excitation de plusieurs
fluorochromes à spectres d’excitation et d’émission bien distincts.
Pour faciliter le choix des fluorochromes, il existe de nombreux outils
sur proposés par des sociétés privées :
Becton
Dickinson,
Thermo
Fischer,
BioLegend,
Chroma...
Avant de démarrer tout protocole d'immuno-marquage il est important de
vérifier la qualité des réactifs utilisés en testant ceux-ci sur des
cellules dont on sait qu'elles présentent l'antigène analysé.
Il faut tester la concentration à laquelle
le réactif est efficace en marquant ces cellules avec diverses
concentrations du réactif et tracer une courbe de l'intensité de marquage
en fonction de cette concentration (Figure 2):
Figure 2 : Effet de la concentration
d'un anticorps sur sa capacité de marquage.
Principes
de la compensation de fluorescence
Les chevauchements des spectres
d’émission des divers fluorochromes utilisés en cytométrie nécessite
l’emploi de compensations électroniques de fluorescence afin de soustraire
la superposition des deux signaux de fluorescence (figure 3).
Figure 3 :
Fuites de fluorescence.
Ainsi, sans compensation de fluorescence,
une population cellulaire marquée en fluorescence verte (FITC) mais non
marquée en fluorescence orange (PE) est positionnée sur la bissectrice de
l’histogramme biparamétrique des deux fluorescences (figure 4a).
Le système de compensation permet de soustraire artificiellement la
fluorescence orange qui résulte de la fuite de fluorescence du FITC dans
le canal de la PE (figure 4b).
Figure 4 : Effet de la compensation de fluorescence
Chaque pourcentage de compensation sera
ainsi déterminé par l’analyse des cellules simplement marquées par les
divers colorants. Il conviendra de régler correctement les cellules
négatives (A) et ensuite d'ajuster la médiane sur y de la population
positive sur x (B) de manière à ce qu'elle soit égale à celle sur y des
cellules négatives (Figure 5).
Figure 5 :
Méthode de calcul de la compensation de fluorescence :
La médiane
de la population B sur l’axe Y doit être égale à la médiane de la
population A sur ce même axe.
Détermination
du seuil de positivité
La pratique courante pour déterminer un seuil de positivité consiste à
utiliser le 'marquage' isotypique et de positionner un curseur au pied du
pic des cellules négatives. Cette pratique n'est pas recommandée dans le
cadre des marquages multiples. En effet, quand plus d’une fluorescence est
présente et que la compensation est réglée, la valeur négative du marquage
peut être plus grande que dans un tube non marqué. Pour pallier à ce
problème il faut utiliser la méthode FMO (fluorescences minus one) qui
consiste à consiste à marquer les cellules avec tous les marqueurs
présents dans l’étude sauf celui d’intérêt (Figure 6).
Figure 6 :
Positionnement du seuil de positivité, méthode FMO
Une fois tous les contrôles et réglages
effectués, les analyses en immunofluorescences peuvent être menées comme
par exemple la recherche de cellules tumorales dans la moelle de
patients atteints de Myélome Multiple (Figure 7)
Figure 7 : Multimarquage pour le
suivi des cellules tumorales dans la moelle de patients atteints de
myélome multiple